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Pushing2012

金虫 (正式写手)

[交流] 蛋白表达

最近表达了个蛋白，用的Pet30做载体，目标蛋白41kDa,IPTG诱导后SDS-PAGE检测在36kDa出现明显新的条带，空白菌和表达菌都在41kda有条带，镍柱纯化后得到的蛋白在41kDa,这个让我无法理解，为什么跑胶时新出现的蛋白在36kDa，而纯化出的蛋白在41kDa。 做酶活测试没有活性，请问在做酶活测试时有没有什么注意事项！请高人赐教!
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1楼 2012-03-31 09:37:30
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whb21

木虫 (著名写手)
★
Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
这个确实有点诡异，建议你做个ELISA看看表达出来的蛋白是不是你要的，
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2楼2012-03-31 10:08:30
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★
Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
表达的蛋白是在上清吗？
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3楼2012-03-31 14:05:00
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sunwei57

木虫 (小有名气)
★
Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
全程低温操作,建议重新跑胶检测 你的蛋白
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4楼2012-03-31 16:17:16
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churchill87426

木虫 (正式写手)
★
Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
LZ的36KDa和41KDa的蛋白位置差别大么？纯化后的蛋白有没有Western检测下是不是目标蛋白？是变性纯化还是Native纯化？纯化过程尽量都在4度操作。
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5楼2012-03-31 18:02:57
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rinp

木虫 (正式写手)
★
Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
打个质谱看看呗，可能降解了?
要是蛋白都符合就甭管了呗~~
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6楼2012-03-31 18:31:47
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bbwalkman

木虫 (小有名气)
★
Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
有降解呢？再重新做一次试试呢？
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7楼2012-03-31 20:03:32
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guojianping

木虫 (正式写手)
★
Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
大小都不一样肯定不对啊，你的蛋白是否可溶？上清，沉淀，全菌都跑SDS看看吧
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8楼2012-03-31 20:51:11
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Pushing2012

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by churchill87426 at 2012-03-31 18:02:57:
LZ的36KDa和41KDa的蛋白位置差别大么？纯化后的蛋白有没有Western检测下是不是目标蛋白？是变性纯化还是Native纯化？纯化过程尽量都在4度操作。

Native的啊！都是4度操作的
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9楼2012-03-31 22:18:00
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Pushing2012

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by guojianping at 2012-03-31 20:51:11:
大小都不一样肯定不对啊，你的蛋白是否可溶？上清，沉淀，全菌都跑SDS看看吧

上清沉淀都有
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10楼2012-03-31 22:18:29
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to-be

金虫 (正式写手)
★
Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
1. 预测的蛋白分子量与实际是有差距的。
2.如果确定41KDa是目标蛋白，36KDa蛋白的出现可能是目标蛋白表达不完全（如果标签在N段，可能应该也会挂Ni柱），也可能是些本底表达的杂蛋白，而目标蛋白表达量很低，不明显。
3. 测酶活注意huffer，温度等因素保持活性。如没有活性，要么失活了，要么不是目标蛋白。建议拿诱导的菌液测酶活。
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11楼2012-03-31 23:11:42
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Pushing2012

金虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by to-be at 2012-03-31 23:11:42:
1. 预测的蛋白分子量与实际是有差距的。
2.如果确定41KDa是目标蛋白，36KDa蛋白的出现可能是目标蛋白表达不完全（如果标签在N段，可能应该也会挂Ni柱），也可能是些本底表达的杂蛋白，而目标蛋白表达量很低，不明 ...

分析的很专业，拿菌液测酶活那个蛋白在细胞里 能不能催化我的反应呢？对了 再弱弱的问下 我的底物溶解性不好 用的是DMSO溶解的，这个DMSO会不会影响酶的活性？
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12楼2012-04-01 08:49:22
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to-be

金虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by Pushing2012 at 2012-04-01 08:49:22:
分析的很专业，拿菌液测酶活那个蛋白在细胞里 能不能催化我的反应呢？对了 再弱弱的问下 我的底物溶解性不好 用的是DMSO溶解的，这个DMSO会不会影响酶的活性？

1.胞内的蛋白会不会分泌出来，取决于目标蛋白的性质，有没有信号肽等因素。
2.DMSO会不会干扰酶活，作对照就知道了。
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15楼2012-04-01 16:59:17
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neu234

木虫之王 (文学泰斗)
★
Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
飘过
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16楼2012-04-01 17:23:16
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guojianping

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by Pushing2012 at 2012-03-31 22:18:29:
上清沉淀都有

看量，是不是上清中蛋白的条带比较亮？如果是的话就是你的纯化方法问题，纯化出来的不是你的蛋白
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17楼2012-04-01 20:41:06
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Rosy_yidun13楼
2012-04-01 10:13   回复  
Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
西瓜: 金币-10, 广告 2012-04-01 18:06:42
西瓜: 编辑内容 2012-04-01 18:06
-- [ Last edited by 西瓜 on 2012-4-1 at 18:06 ]
Rosy_yidun14楼
2012-04-01 10:14   回复  
西瓜: 编辑内容 2012-04-01 18:06
-- [ Last edited by 西瓜 on 2012-4-1 at 18:06 ]
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