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Pushing2012

金虫 (正式写手)


[交流] 蛋白表达

最近表达了个蛋白,用的Pet30做载体,目标蛋白41kDa,IPTG诱导后SDS-PAGE检测在36kDa出现明显新的条带,空白菌和表达菌都在41kda有条带,镍柱纯化后得到的蛋白在41kDa,这个让我无法理解,为什么跑胶时新出现的蛋白在36kDa,而纯化出的蛋白在41kDa。 做酶活测试没有活性,请问在做酶活测试时有没有什么注意事项!请高人赐教!
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to-be

金虫 (正式写手)



Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
1. 预测的蛋白分子量与实际是有差距的。
2.如果确定41KDa是目标蛋白,36KDa蛋白的出现可能是目标蛋白表达不完全(如果标签在N段,可能应该也会挂Ni柱),也可能是些本底表达的杂蛋白,而目标蛋白表达量很低,不明显。
3. 测酶活注意huffer,温度等因素保持活性。如没有活性,要么失活了,要么不是目标蛋白。建议拿诱导的菌液测酶活。
11楼2012-03-31 23:11:42
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whb21

木虫 (著名写手)



Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
这个确实有点诡异,建议你做个ELISA看看表达出来的蛋白是不是你要的,
2楼2012-03-31 10:08:30
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Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
表达的蛋白是在上清吗?
3楼2012-03-31 14:05:00
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sunwei57

木虫 (小有名气)



Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
全程低温操作,建议重新跑胶检测 你的蛋白
4楼2012-03-31 16:17:16
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Rosy_yidun13楼
2012-04-01 10:13   回复  
Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
西瓜: 金币-10, 广告 2012-04-01 18:06:42
西瓜: 编辑内容 2012-04-01 18:06
-- [ Last edited by 西瓜 on 2012-4-1 at 18:06 ]
Rosy_yidun14楼
2012-04-01 10:14   回复  
西瓜: 编辑内容 2012-04-01 18:06
-- [ Last edited by 西瓜 on 2012-4-1 at 18:06 ]
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