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thestormcong

银虫 (小有名气)

[求助] red基因敲除转化子

小弟最近做了一轮电转化,转化子数量也还可以,20个左右,可是暂时挑取的转化子都是假阳性,pcr条带的大小跟野生株的一样,目的基因没有被置换。怀疑是不是转化的时候模板没有去除干净的原因。我用dpnI消化,再切胶回收。50ulpcr产物加1ul的酶和3ul的T buffer。请教各位有经验的虫子给点建议。还有在这些转化子里面,如果我接着挑,有没有可能挑到我想要的呢?
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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小丹木木: , 鼓励应助 2012-03-30 11:17:48
thestormcong: 金币+8 2012-04-06 22:29:57
red同源重组的缺失方法中,带抗性的目的片段应该是从质粒上PCR得来的吧?最好能在PCR之前将质粒酶切线性化,而且将第一轮PCR的产物回收作为模板进行第二轮PCR,回收第二轮的产物电转进入待缺失的细菌,这样可以有效避免假阳性的出现
我有一个梦想,我梦想有一天,我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力,居住在自己愿意居住的地方。
2楼2012-03-29 22:42:05
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thestormcong

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaohq1209 at 2012-03-29 22:42:05:
red同源重组的缺失方法中,带抗性的目的片段应该是从质粒上PCR得来的吧?最好能在PCR之前将质粒酶切线性化,而且将第一轮PCR的产物回收作为模板进行第二轮PCR,回收第二轮的产物电转进入待缺失的细菌,这样可以有 ...

好的,谢谢建议。
3楼2012-03-29 22:53:01
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thestormcong

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaohq1209 at 2012-03-29 22:42:05:
red同源重组的缺失方法中,带抗性的目的片段应该是从质粒上PCR得来的吧?最好能在PCR之前将质粒酶切线性化,而且将第一轮PCR的产物回收作为模板进行第二轮PCR,回收第二轮的产物电转进入待缺失的细菌,这样可以有 ...

我回收了第二轮的pcr产物,但是好像浓度不够(条带不亮),于是我将第二轮的pcr产物作为模板进行扩增,奇怪的是竟然没有能够扩增出来,不知道是什么情况,望求助!
4楼2012-04-06 22:32:03
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