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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » red基因敲除转化子
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thestormcong

银虫 (小有名气)

[求助] red基因敲除转化子

小弟最近做了一轮电转化，转化子数量也还可以，20个左右，可是暂时挑取的转化子都是假阳性，pcr条带的大小跟野生株的一样，目的基因没有被置换。怀疑是不是转化的时候模板没有去除干净的原因。我用dpnI消化，再切胶回收。50ulpcr产物加1ul的酶和3ul的T buffer。请教各位有经验的虫子给点建议。还有在这些转化子里面，如果我接着挑，有没有可能挑到我想要的呢？
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1楼 2012-03-29 21:25:56
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: , 鼓励应助 2012-03-30 11:17:48
thestormcong: 金币+8 2012-04-06 22:29:57
red同源重组的缺失方法中，带抗性的目的片段应该是从质粒上PCR得来的吧？最好能在PCR之前将质粒酶切线性化，而且将第一轮PCR的产物回收作为模板进行第二轮PCR，回收第二轮的产物电转进入待缺失的细菌，这样可以有效避免假阳性的出现
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
2楼2012-03-29 22:42:05
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thestormcong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaohq1209 at 2012-03-29 22:42:05:
red同源重组的缺失方法中，带抗性的目的片段应该是从质粒上PCR得来的吧？最好能在PCR之前将质粒酶切线性化，而且将第一轮PCR的产物回收作为模板进行第二轮PCR，回收第二轮的产物电转进入待缺失的细菌，这样可以有 ...

好的，谢谢建议。
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3楼2012-03-29 22:53:01
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thestormcong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaohq1209 at 2012-03-29 22:42:05:
red同源重组的缺失方法中，带抗性的目的片段应该是从质粒上PCR得来的吧？最好能在PCR之前将质粒酶切线性化，而且将第一轮PCR的产物回收作为模板进行第二轮PCR，回收第二轮的产物电转进入待缺失的细菌，这样可以有 ...

我回收了第二轮的pcr产物，但是好像浓度不够（条带不亮），于是我将第二轮的pcr产物作为模板进行扩增，奇怪的是竟然没有能够扩增出来，不知道是什么情况，望求助！
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4楼2012-04-06 22:32:03
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