| 查看: 2022 | 回复: 8 | |||||
[交流]
N-末端 氨基酸测序——转膜问题
|
|||||
|
各位虫友： 小虫用SDS-PAGE识别到一个分子量110kDa左右（0.75mm）胶，只是想知道N-末端20个氨基酸顺序，不需要保持其活性，之后送到测序公司进行氨基酸识别。已经在网上和自己实践后进行了转膜实验，效果不是很理想。想和虫友共同探讨和完善转膜方案，以便后续试验顺利进行： 我用PVDF膜进行转膜，然后准备进行N-端氨基酸测序. 1. SDS-PAGE是还原电泳，用考马斯蓝染色条带清晰。 1. PVDF膜放在甲醇里漂洗，去除膜中气泡，便于蛋白转移。 3. 转膜缓冲液用CAPS pH11。 2. 制作三明治。用60V或100v电压转了一个小时，染色用立春红S几分钟。 可能细节还有问题，期望虫友和有经验的老师提供建议，提供详细方案和建议。之后再进行整理，以便实验顺利进行！ |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 经典资源帖 | 蛋白质生物学实验经验 |
» 猜你喜欢
求调剂
已经有4人回复
-
0854求调剂
已经有27人回复
-
材料相关专业344求调剂双非工科学校或课题组
已经有27人回复
-
300求调剂
已经有12人回复
-
291求调剂
已经有10人回复
-
一志愿沪9，326求生物学调剂
已经有12人回复
-
生物学调剂
已经有10人回复
-
320求调剂
已经有5人回复
-
接受任何调剂
已经有7人回复
-
化学070300 求调剂
已经有29人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 关于测游离氨基酸的两张方法 询问大家！
已经有6人回复
- 高等学校青年骨干教师国内访问学者——请大家帮我参考一下这个情况，谢谢
已经有31人回复
- 考研复习资料——马哲图表（细致、全面）
已经有19人回复
- 铸膜液脱泡问题
已经有20人回复
- 关于DNA测序末端终止法的一点问题？
已经有9人回复
- 【求助/交流】测序出来的序列如何转换成氨基酸序列进行比对？
已经有9人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
广东石油化工学院环境工程专业硕士生，大类07，08，09都可以调剂，先到先得！
+1/485
-
苏州国家实验室---南京大学联合培养博士招生（2026秋季入学）
+5/255
-
考研落榜生看过来
+1/88
-
盐城师范学院生物与医药（生物技术与工程领域）还有调剂名额
+1/36
-
硕士招生 吉林化工大学 功能多孔材料课题组招考研学生1-2名
+1/33
-
浙江大学高分子系毛峥伟教授招收科研助理
+1/31
-
上海交通大学-电气工程学院-高温超导磁体-2026年秋季入学全日制博士生招聘
+1/21
-
佛山大学动物科技学院2026年硕士研究生招生调剂公告（第三批）
+1/20
-
大家好，请教个问题，连续挤出胶皮，有没有在线降低气味VOC的方式。
+1/19
-
中科院合肥物质研究院招聘水系锌电博士后（长期有效）诚聘海内外优秀博士后
+1/16
-
南京林业大学-国家级青年人才团队 招2026级申请考核制博士 （有机合成化学方向）
+1/16
-
香港科技大学用于先进LCD器件的偏振发射钙钛矿纳米棒增强薄膜
+2/12
-
河南省医学科学院王宁利院士/苗彦彦研究员科研团队、伏羲慧眼云平台团队2026年博士、�
+1/9
-
南京大学FinTech大模型实验室招募斯坦福国际联培博士生和博士后及科研助理
+1/8
-
中国科学技术大学苏州高等研究院凤建岗课题组诚招博士后
+1/7
-
北化大学材料科学与工程学院研究生调剂
+1/7
-
青岛科技大学高分子学院硕士招生
+1/7
-
中山大学附属第三医院生物材料与转化医学实验室2026级博士招生
+1/1
-
2026年华南师范大学光电科学与工程学院魏嵬课题组招收硕士调剂生
+1/1
-
郑州大学物理学院倪佩楠教授课题组诚邀博士后、青年教师及副教授加盟
+1/1
2楼2012-03-12 20:10:03
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5): 给个红包，谢谢回帖
lizhijiang(金币+10): 很全面，十分感谢！ 2012-03-13 08:25:47
wizardfan: 金币+10, 谢谢分享经验 2012-08-31 04:55:06
小木虫(金币+0.5): 给个红包，谢谢回帖
lizhijiang(金币+10): 很全面，十分感谢！ 2012-03-13 08:25:47
wizardfan: 金币+10, 谢谢分享经验 2012-08-31 04:55:06
|
（1)配制CAPS[3－（环己氨基）－1－丙磺酸，3-(cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid]电印迹缓冲液：10×CAPS（100mmol/L）：取 CAPS 22.13g，加去离子水至900mL，用2mol/L NaOH （约20mL）将pH值调至11.0，然后定容至1L，贮存于4oC。 （2)CAPS电印迹缓冲液（含10％甲醇的1×CAPS）：取10×CAPS 200 mL,加甲醇200 mL，去离子水1600 mL。 （3)取出PVDF膜（Positively charged nylon，Polyvinylidene fluoride，聚偏二氟乙烯膜），用甲醇浸泡数秒钟，然后放入CAPS电印迹缓冲液中。（注：以后的操作须防止PVDF膜干涸。如果膜变干，须重复本步骤的操作；CAPS电印迹缓冲液中的甲醇浓度范围是0-20％，一般甲醇浓度高的缓冲液对低分子量蛋白的转移效果好，而甲醇浓度低甚至不含甲醇的缓冲液则有利于高分子量蛋白的转移。） （4)取出电泳凝胶，在CAPS缓冲液中浸泡5-10分钟。 （5)将用于电印迹实验的滤纸和海绵放入电印迹缓冲液中浸泡一下，然后按海绵、滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸、海绵的次序将电印迹夹层装好，并放入小型电转槽中，用50V恒压条件下跑空胶2-2.5小时预电泳后再上蛋白样品进行电泳分离。在50V恒压条件下（100-170mA）于室温下进行电印迹转移，转移时间为0.5-2小时。（注：务必小心排尽凝胶和PVDF膜之间的气泡。上述转移条件适用于Bio-Rad小型电转槽和分子量不太大的蛋白。在不同的实验中，应根据具体的电转移装置和具体蛋白适当调整电转移条件。例如对70kD以上的蛋白质须延长转移时间。） （6) 取出PVDF膜并用去离子水略为漂洗，用甲醇浸泡数秒钟，然后进行染色。 （7) 考马斯亮蓝染色，可将0.1％考马斯亮蓝R-250溶于40％甲醇/1％乙酸，染色30-50秒（切勿超过1分钟），用50％甲醇脱色（注意勤换脱色液），并用去离子水充分洗涤，然后即可剪下待测序的条带，送上海基康生物技术公司进行蛋白质端测序(蛋白质序列测序系统:ABI PROCISETM492cLC)。 |
3楼2012-03-12 21:25:23
5楼2012-03-12 21:26:53
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
|
本帖内容被屏蔽 |
6楼2012-07-21 19:00:48
冼亮淀粉酶
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +248 - BioEPI: 73
- 应助: 257 (大学生)
- 贵宾: 0.272
- 金币: 19527.4
- 帖子: 6591
- 在线: 2781.4小时
- 虫号: 856414
7楼2012-07-22 14:38:21
8楼2012-07-23 09:01:59
9楼2012-08-29 16:10:55
简单回复
QIN07184楼
2012-03-12 21:26
回复
