24小时热门版块排行榜

返回列表

lizhijiang

木虫 (著名写手)

应助: 18 (小学生)
金币: 3588.3
帖子: 1364
在线: 483.2小时
虫号: 848418

[交流] N-末端氨基酸测序——转膜问题

各位虫友：
小虫用SDS-PAGE识别到一个分子量110kDa左右（0.75mm）胶，只是想知道N-末端20个氨基酸顺序，不需要保持其活性，之后送到测序公司进行氨基酸识别。已经在网上和自己实践后进行了转膜实验，效果不是很理想。想和虫友共同探讨和完善转膜方案，以便后续试验顺利进行：
我用PVDF膜进行转膜，然后准备进行N-端氨基酸测序.
1. SDS-PAGE是还原电泳，用考马斯蓝染色条带清晰。
1. PVDF膜放在甲醇里漂洗，去除膜中气泡，便于蛋白转移。
3. 转膜缓冲液用CAPS pH11。
2. 制作三明治。用60V或100v电压转了一个小时，染色用立春红S几分钟。
可能细节还有问题，期望虫友和有经验的老师提供建议，提供详细方案和建议。之后再进行整理，以便实验顺利进行！

回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

经典资源帖

蛋白质生物学实验经验

» 猜你喜欢

售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急已经有3人回复
售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急已经有3人回复
售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急已经有3人回复
售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急已经有3人回复
售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急已经有5人回复
售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急已经有7人回复
上海工程技术大学激光智能制造课题组 2027级博士研究生招生已经有6人回复
课题组招2027级博士上海工程技术大学激光智能制造方向已经有6人回复
现代”学阀”该如何界定已经有14人回复
师弟论文见刊大半年才想起来申请专利，还能抢救一下吗？已经有4人回复

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

关于测游离氨基酸的两张方法询问大家！已经有6人回复
高等学校青年骨干教师国内访问学者——请大家帮我参考一下这个情况，谢谢已经有31人回复
考研复习资料——马哲图表（细致、全面）已经有19人回复
铸膜液脱泡问题已经有20人回复
关于DNA测序末端终止法的一点问题？已经有9人回复
【求助/交流】测序出来的序列如何转换成氨基酸序列进行比对？已经有9人回复

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴

1楼 2012-03-12 19:49:57

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

lizhijiang

木虫 (著名写手)

应助: 18 (小学生)
金币: 3588.3
帖子: 1364
在线: 483.2小时
虫号: 848418

等待建议，十分感谢！

赞一下

回复此楼

2楼2012-03-12 20:10:03

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

QIN0718

至尊木虫 (职业作家)

应助: 2 (幼儿园)
金币: 21349.6
帖子: 4076
在线: 231.4小时
虫号: 419949

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5): 给个红包，谢谢回帖
lizhijiang(金币+10): 很全面，十分感谢！ 2012-03-13 08:25:47
wizardfan: 金币+10, 谢谢分享经验 2012-08-31 04:55:06

（1)配制CAPS[3－（环己氨基）－1－丙磺酸，3-(cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid]电印迹缓冲液：10×CAPS（100mmol/L）：取 CAPS 22.13g，加去离子水至900mL，用2mol/L NaOH （约20mL）将pH值调至11.0，然后定容至1L，贮存于4oC。
（2)CAPS电印迹缓冲液（含10％甲醇的1×CAPS）：取10×CAPS 200 mL,加甲醇200 mL，去离子水1600 mL。
（3)取出PVDF膜（Positively charged nylon，Polyvinylidene fluoride，聚偏二氟乙烯膜），用甲醇浸泡数秒钟，然后放入CAPS电印迹缓冲液中。（注：以后的操作须防止PVDF膜干涸。如果膜变干，须重复本步骤的操作；CAPS电印迹缓冲液中的甲醇浓度范围是0-20％，一般甲醇浓度高的缓冲液对低分子量蛋白的转移效果好，而甲醇浓度低甚至不含甲醇的缓冲液则有利于高分子量蛋白的转移。）
（4)取出电泳凝胶，在CAPS缓冲液中浸泡5-10分钟。
（5)将用于电印迹实验的滤纸和海绵放入电印迹缓冲液中浸泡一下，然后按海绵、滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸、海绵的次序将电印迹夹层装好，并放入小型电转槽中，用50V恒压条件下跑空胶2-2.5小时预电泳后再上蛋白样品进行电泳分离。在50V恒压条件下（100-170mA）于室温下进行电印迹转移，转移时间为0.5-2小时。（注：务必小心排尽凝胶和PVDF膜之间的气泡。上述转移条件适用于Bio-Rad小型电转槽和分子量不太大的蛋白。在不同的实验中，应根据具体的电转移装置和具体蛋白适当调整电转移条件。例如对70kD以上的蛋白质须延长转移时间。）
（6) 取出PVDF膜并用去离子水略为漂洗，用甲醇浸泡数秒钟，然后进行染色。
（7) 考马斯亮蓝染色，可将0.1％考马斯亮蓝R-250溶于40％甲醇/1％乙酸，染色30-50秒（切勿超过1分钟），用50％甲醇脱色（注意勤换脱色液），并用去离子水充分洗涤，然后即可剪下待测序的条带，送上海基康生物技术公司进行蛋白质端测序(蛋白质序列测序系统:ABI PROCISETM492cLC)。

赞一下(1人)

回复此楼

3楼2012-03-12 21:25:23

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖