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[交流]
N-末端 氨基酸测序——转膜问题
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各位虫友： 小虫用SDS-PAGE识别到一个分子量110kDa左右（0.75mm）胶，只是想知道N-末端20个氨基酸顺序，不需要保持其活性，之后送到测序公司进行氨基酸识别。已经在网上和自己实践后进行了转膜实验，效果不是很理想。想和虫友共同探讨和完善转膜方案，以便后续试验顺利进行： 我用PVDF膜进行转膜，然后准备进行N-端氨基酸测序. 1. SDS-PAGE是还原电泳，用考马斯蓝染色条带清晰。 1. PVDF膜放在甲醇里漂洗，去除膜中气泡，便于蛋白转移。 3. 转膜缓冲液用CAPS pH11。 2. 制作三明治。用60V或100v电压转了一个小时，染色用立春红S几分钟。 可能细节还有问题，期望虫友和有经验的老师提供建议，提供详细方案和建议。之后再进行整理，以便实验顺利进行！ |
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8楼2012-07-23 09:01:59
2楼2012-03-12 20:10:03
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小木虫(金币+0.5): 给个红包，谢谢回帖
lizhijiang(金币+10): 很全面，十分感谢！ 2012-03-13 08:25:47
wizardfan: 金币+10, 谢谢分享经验 2012-08-31 04:55:06
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lizhijiang(金币+10): 很全面，十分感谢！ 2012-03-13 08:25:47
wizardfan: 金币+10, 谢谢分享经验 2012-08-31 04:55:06
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（1)配制CAPS[3－（环己氨基）－1－丙磺酸，3-(cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid]电印迹缓冲液：10×CAPS（100mmol/L）：取 CAPS 22.13g，加去离子水至900mL，用2mol/L NaOH （约20mL）将pH值调至11.0，然后定容至1L，贮存于4oC。 （2)CAPS电印迹缓冲液（含10％甲醇的1×CAPS）：取10×CAPS 200 mL,加甲醇200 mL，去离子水1600 mL。 （3)取出PVDF膜（Positively charged nylon，Polyvinylidene fluoride，聚偏二氟乙烯膜），用甲醇浸泡数秒钟，然后放入CAPS电印迹缓冲液中。（注：以后的操作须防止PVDF膜干涸。如果膜变干，须重复本步骤的操作；CAPS电印迹缓冲液中的甲醇浓度范围是0-20％，一般甲醇浓度高的缓冲液对低分子量蛋白的转移效果好，而甲醇浓度低甚至不含甲醇的缓冲液则有利于高分子量蛋白的转移。） （4)取出电泳凝胶，在CAPS缓冲液中浸泡5-10分钟。 （5)将用于电印迹实验的滤纸和海绵放入电印迹缓冲液中浸泡一下，然后按海绵、滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸、海绵的次序将电印迹夹层装好，并放入小型电转槽中，用50V恒压条件下跑空胶2-2.5小时预电泳后再上蛋白样品进行电泳分离。在50V恒压条件下（100-170mA）于室温下进行电印迹转移，转移时间为0.5-2小时。（注：务必小心排尽凝胶和PVDF膜之间的气泡。上述转移条件适用于Bio-Rad小型电转槽和分子量不太大的蛋白。在不同的实验中，应根据具体的电转移装置和具体蛋白适当调整电转移条件。例如对70kD以上的蛋白质须延长转移时间。） （6) 取出PVDF膜并用去离子水略为漂洗，用甲醇浸泡数秒钟，然后进行染色。 （7) 考马斯亮蓝染色，可将0.1％考马斯亮蓝R-250溶于40％甲醇/1％乙酸，染色30-50秒（切勿超过1分钟），用50％甲醇脱色（注意勤换脱色液），并用去离子水充分洗涤，然后即可剪下待测序的条带，送上海基康生物技术公司进行蛋白质端测序(蛋白质序列测序系统:ABI PROCISETM492cLC)。 |
3楼2012-03-12 21:25:23
5楼2012-03-12 21:26:53
