应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » N-末端 氨基酸测序——转膜问题
91/1返回列表
查看: 1913  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

lizhijiang

木虫 (著名写手)

[交流] N-末端 氨基酸测序——转膜问题

各位虫友：
    小虫用SDS-PAGE识别到一个分子量110kDa左右（0.75mm）胶，只是想知道N-末端20个氨基酸顺序，不需要保持其活性，之后送到测序公司进行氨基酸识别。已经在网上和自己实践后进行了转膜实验，效果不是很理想。想和虫友共同探讨和完善转膜方案，以便后续试验顺利进行：
    我用PVDF膜进行转膜，然后准备进行N-端氨基酸测序.
1. SDS-PAGE是还原电泳，用考马斯蓝染色条带清晰。
1. PVDF膜放在甲醇里漂洗，去除膜中气泡，便于蛋白转移。
3. 转膜缓冲液用CAPS pH11。
2. 制作三明治。用60V或100v电压转了一个小时，染色用立春红S几分钟。
  可能细节还有问题，期望虫友和有经验的老师提供建议，提供详细方案和建议。之后再进行整理，以便实验顺利进行！
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

经典资源帖 蛋白质生物学实验经验

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2012-03-12 19:49:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lizhijiang

木虫 (著名写手)
等待建议，十分感谢！
赞一下 回复此楼
2楼2012-03-12 20:10:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

QIN0718

至尊木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5): 给个红包，谢谢回帖
lizhijiang(金币+10): 很全面，十分感谢！ 2012-03-13 08:25:47
wizardfan: 金币+10, 谢谢分享经验 2012-08-31 04:55:06
（1)配制CAPS[3－（环己氨基）－1－丙磺酸，3-(cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid]电印迹缓冲液：10×CAPS（100mmol/L）：取 CAPS 22.13g，加去离子水至900mL，用2mol/L NaOH （约20mL）将pH值调至11.0，然后定容至1L，贮存于4oC。
（2)CAPS电印迹缓冲液（含10％甲醇的1×CAPS）：取10×CAPS 200 mL,加甲醇200 mL，去离子水1600 mL。
（3)取出PVDF膜（Positively charged nylon，Polyvinylidene fluoride，聚偏二氟乙烯膜），用甲醇浸泡数秒钟，然后放入CAPS电印迹缓冲液中。（注：以后的操作须防止PVDF膜干涸。如果膜变干，须重复本步骤的操作；CAPS电印迹缓冲液中的甲醇浓度范围是0-20％，一般甲醇浓度高的缓冲液对低分子量蛋白的转移效果好，而甲醇浓度低甚至不含甲醇的缓冲液则有利于高分子量蛋白的转移。）
（4)取出电泳凝胶，在CAPS缓冲液中浸泡5-10分钟。
（5)将用于电印迹实验的滤纸和海绵放入电印迹缓冲液中浸泡一下，然后按海绵、滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸、海绵的次序将电印迹夹层装好，并放入小型电转槽中，用50V恒压条件下跑空胶2-2.5小时预电泳后再上蛋白样品进行电泳分离。在50V恒压条件下（100-170mA）于室温下进行电印迹转移，转移时间为0.5-2小时。（注：务必小心排尽凝胶和PVDF膜之间的气泡。上述转移条件适用于Bio-Rad小型电转槽和分子量不太大的蛋白。在不同的实验中，应根据具体的电转移装置和具体蛋白适当调整电转移条件。例如对70kD以上的蛋白质须延长转移时间。）
（6) 取出PVDF膜并用去离子水略为漂洗，用甲醇浸泡数秒钟，然后进行染色。
（7) 考马斯亮蓝染色，可将0.1％考马斯亮蓝R-250溶于40％甲醇/1％乙酸，染色30-50秒（切勿超过1分钟），用50％甲醇脱色（注意勤换脱色液），并用去离子水充分洗涤，然后即可剪下待测序的条带，送上海基康生物技术公司进行蛋白质端测序(蛋白质序列测序系统:ABI PROCISETM492cLC)。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2012-03-12 21:25:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

QIN0718

至尊木虫 (职业作家)
这是我转膜的方案，做了很多次，没有问题的。
赞一下 回复此楼
5楼2012-03-12 21:26:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lilyai725

禁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
6楼2012-07-21 19:00:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可以寄出去让公司转膜测序吗？卡在一步上很浪费时间的。
赞一下 回复此楼
7楼2012-07-22 14:38:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lizhijiang

木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2012-07-22 14:38:21
可以寄出去让公司转膜测序吗？卡在一步上很浪费时间的。

兄，在国外，很贵的，老板钱又不厚！
赞一下 回复此楼
8楼2012-07-23 09:01:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

8638600

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
好像40kd以下的才建议立春红S染色……我也不是很清楚……同学习……
赞一下 回复此楼
9楼2012-08-29 16:10:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
简单回复
QIN07184楼
2012-03-12 21:26   回复  
相关版块跳转 我要订阅楼主 lizhijiang 的主题更新
91/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 0817 化学工程 299分求调剂 有科研经历 有二区文章 +13 rare12345 2026-03-18 13/650 2026-03-19 17:30 by jean5056
[考研] 324分 085600材料化工求调剂 +3 llllkkkhh 2026-03-18 3/150 2026-03-19 14:22 by houyaoxu
[考研] 求调剂 +3 Mqqqqqq 2026-03-19 3/150 2026-03-19 14:11 by peike
[考研] 281求调剂（0805） +9 烟汐忆海 2026-03-16 19/950 2026-03-19 11:42 by laoshidan
[考研] 267一志愿南京工业大学0817化工求调剂 +10 SUICHILD 2026-03-12 10/500 2026-03-19 09:51 by Delta2012
[考研] 材料与化工一志愿南昌大学327求调剂推荐 +8 Ncdx123456 2026-03-13 9/450 2026-03-18 14:40 by haxia
[考研] 一志愿西南交大，求调剂 +4 材化逐梦人 2026-03-18 4/200 2026-03-18 14:22 by 007_lilei
[考研] 材料专硕306英一数二 +10 z1z2z3879 2026-03-16 13/650 2026-03-18 14:20 by 007_lilei
[考研] 收复试调剂生 +4 雨后秋荷 2026-03-18 4/200 2026-03-18 14:16 by elevennnne
[考研] 326求调剂 +5 上岸的小葡 2026-03-15 6/300 2026-03-17 17:26 by ruiyingmiao
[考研] 332求调剂 +6 Zz版 2026-03-13 6/300 2026-03-17 17:03 by ruiyingmiao
[考研] 211本，11408一志愿中科院277分，曾在中科院自动化所实习 +6 Losir 2026-03-12 7/350 2026-03-17 12:09 by danranxie
[考研] 274求调剂 +5 时间点 2026-03-13 5/250 2026-03-17 07:34 by 热情沙漠
[考研] 22408总分284求调剂 +3 InAspic 2026-03-13 3/150 2026-03-15 11:10 by zhq0425
[考研] 中科大材料与化工319求调剂 +3 孟鑫材料 2026-03-14 3/150 2026-03-14 20:10 by ms629
[考研] 材料与化工 323 英一+数二+物化，一志愿：哈工大 本人本科双一流 +4 自由的_飞翔 2026-03-13 5/250 2026-03-14 19:39 by hmn_wj
[考研] 328求调剂 +3 5201314Lsy！ 2026-03-13 6/300 2026-03-14 15:31 by hyswxzs
[考研] 266求调剂 +4 学员97LZgn 2026-03-13 4/200 2026-03-14 08:37 by zhukairuo
[考研] 26调剂/材料科学与工程/总分295/求收留 +9 2026调剂侠 2026-03-12 9/450 2026-03-13 20:46 by 18595523086
[考博] 福州大学杨黄浩课题组招收2026年专业学位博士研究生，2026.03.20截止 +3 Xiangyu_ou 2026-03-12 3/150 2026-03-13 09:36 by duanwu655
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭