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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 转基因 » 转基因植株的RT-PCR结果分析
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嫘诺

新虫 (小有名气)

[求助] 转基因植株的RT-PCR结果分析

转基因水稻（日本晴）分子检测：提取经过农杆菌侵染法获得的转基因水稻在DNA水平上检测，获得了目的条带约1750bp，然后进行RT-PCR分析，结果如下图所示。问题：检测得到的非特异性条带约750bp，测序可知是目的基因的一部分，目的条带1750bp存在但不亮，问一下有哪位能帮解释下，这棵转基因苗是否可用？

RT-PCR结果
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1楼 2012-03-07 09:56:04
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可转到分子生物版发帖！
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真相是最大的奢侈品
2楼2012-03-07 19:55:08
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wiln1

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
嫘诺(金币+10): ★有帮助 4 2012-03-08 09:30:19
1.是不是提取过程中基因组被打断了，因为基因组在提取过程中和容易被打断，而被打断的部分恰好就是你的插入基因。
2.也有可能你构建的载体本身就有问题。
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3楼2012-03-08 07:30:44
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脱水拂空

铜虫 (正式写手)
你可以再调一下退火温度 再看看 或者用LATaq 酶的两步法扩一下看看 转基因中存在着好多问题
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4楼2012-03-08 10:31:03
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xiaoyur

金虫 (著名写手)
1.提高退火温度，2.重新设计特异引物，3.目标条带测序4.确定正常转录再做下一步。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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爱的反义词不是恨 而是冷漠!
5楼2012-03-10 08:36:38
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嫘诺

新虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by wiln1 at 2012-03-08 07:30:44:
1.是不是提取过程中基因组被打断了，因为基因组在提取过程中和容易被打断，而被打断的部分恰好就是你的插入基因。
2.也有可能你构建的载体本身就有问题。

谢谢！那我想问一下怎么样才能避免基因组被打断的情况发生呢？
这和载体有什么关系？
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6楼2012-03-10 09:47:31
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嫘诺

新虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 脱水拂空 at 2012-03-08 10:31:03:
你可以再调一下退火温度 再看看 或者用LATaq 酶的两步法扩一下看看 转基因中存在着好多问题

谢谢！退火温度已经提到60度了，已经很高了啊！LATaq酶两步法是什么方法？
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7楼2012-03-10 09:48:59
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嫘诺

新虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by xiaoyur at 2012-03-10 08:36:38:
1.提高退火温度，2.重新设计特异引物，3.目标条带测序4.确定正常转录再做下一步。

谢谢！温度已经提高了啊！至于引物，因为我是接着师姐的做的，引物是她设计的应该没什么大问题！
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8楼2012-03-10 09:56:06
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wiln1

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
SongQ5285(金币+3): 鼓励交流 2012-03-10 19:23:13
引用回帖:
6楼: Originally posted by 嫘诺 at 2012-03-10 09:47:31:
谢谢！那我想问一下怎么样才能避免基因组被打断的情况发生呢？
这和载体有什么关系？

避免提取过程中基因组被打断主要就是提取时混匀时要轻柔，不要太剧烈。提取完后跑一下胶。看看是不是一条带。
构建载体时，要是有的插入的不是基因全长，而是一段基因，也可能造成这种情况。还有插入的基因容易丢失。
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9楼2012-03-10 11:55:44
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