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[求助]
求助2个关于组蛋白的问题，与检测乙酰化和泛素化有关
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没有做过组蛋白这方面，实验室其他师兄们也较少涉及，查文献上面基本都是略过... 然后我现在涉及的一个实验中要检测H3的乙酰化，和H2B的泛素化水平。有几个问题不解。 求检测这两者的protocol呀！！ koddisy@gmail.com 跪谢 然后我的问题如下： 1.第一个是组蛋白抽提的问题，用组蛋白试剂盒抽的组蛋白一般是抽得所有组蛋白，还是有不同的试剂盒，可以直接抽到H3？ 还是在设计的时候就已经加入纯化标签，比如H2B-FLAG，然后纯化H2B。。。我真不清楚~~ 2.乙酰化怎么检测，比如我要检测H3的global的乙酰化水平。又如果我要检测的只是H3K18的乙酰化可以实现吗？乙酰化也是买抗体检测吗？ 3.H2B的泛素化怎么检测？我看文献上是直接用泛素化抗体来检测的，是的嘛？ 实在是不清楚，请不要笑话我呢，我也是为了能顺利做实验~~~ 跪求protocol~~~不甚感激。现在满脑子的疑惑啊！！！ |
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chlorella409
木虫 (正式写手)
- BioEPI: 1
- 应助: 88 (初中生)
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- 注册: 2012-02-05
- 性别: GG
- 专业: 蛋白质组学
3楼2012-03-26 14:09:50
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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大量样品测试，用快速检测组蛋白乙酰化的ELISA方法比较简单，这是南宁蓝光生物技术公司采用的方法： 1） 将处理的细胞（潜在HDAC inhibitor处理？）悬浮液在1.5mL离心管于3000转离心1分钟， 去调上清。 细胞pelet留下萃取组蛋白 2）用50 uL的0.1 N的HCL萃取5uL左右的离心沉淀的处理细胞pelet中的组蛋白。 用移液枪头反复上下吸放混细胞，以利细胞破裂和组蛋白释放。然后没隔5分钟vortex一次。连续3-4次后与12000转离心5分钟。 取含有组蛋白的上清液。（组蛋白是碱性蛋白，在0.1N盐酸下带强正电荷而高度溶于水。 其他细胞蛋白基本因此变性而沉淀。这种萃取方法的总组蛋白纯度可达50%以上）。 3 ）用移液枪在96孔板加80uL/well的0.2M的Na2CO3。 然后孔中加20uL在2）中萃取的组蛋白上清。要慢，防止CO2的突然冒出。于37度孵化30分钟。 4）倒掉孔中溶液，加100uL/well的1%BSA in PBSt。 封闭30分钟 5）用PBSt清洗well 4次， 加入0.25 ug/mL的抗乙酰赖氨酸抗体HRP标记（用1%BSA in PBSt稀释）于室温孵化30分钟。 6）倒掉孔中溶液，用PBSt清洗 4次。 然后加100uL/well的HRP底物TMB显色。组蛋白的乙酰化程度与颜色成正比。 抗乙酰化赖氨酸抗体HRP和TMB， 及各种乙酰化蛋白组学所需抗体及填料在国内的南宁蓝光生物技术（www.bl-biotech.com) 均有售。 |
2楼2012-03-26 10:55:21
