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houhoujiayou

银虫 (小有名气)

[交流] 怎样鉴定毕赤（GS115）重组菌是胞内还是胞外表达

我最近在做毕赤酵母的表达。一直以为只要在GS115中表达的都是分泌型，但是看了一下好象不是。请教这方面的高手，怎么鉴定？我是直接用EcoR I 单酶切位点插入pPic9k上的多克隆位点的，做了MM/MD平板鉴定，重组子是甲醇利用缓慢型的，可是做过两次发酵了，取的上清跑蛋白电泳好像是比空白多了一个条带（条带都比较浅，所以不确定）可是测定酶活时是没有酶活的。请问大家都是怎么做的？比较急，希望多出建议，谢谢
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1楼 2011-12-29 15:52:06
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zuoyue911

禁虫 (初入文坛)
★
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4楼2011-12-31 02:57:02
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susizheng

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good! 2011-12-29 17:32:25
houhoujiayou(金币+5): 谢谢你的回答，我已经用超滤管浓缩了 2012-01-02 13:56:01
是否是分泌型表达，是看你用的载体，不是看宿主。
pPic9k是分泌型表达载体，因此你的蛋白是分泌到胞外地。
没有酶活也可能是你蛋白含量较少，做浓缩吧，利用超滤管就行。
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2楼2011-12-29 16:35:32
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austin2008

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
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西瓜(金币+1): 鼓励交流！ 2011-12-30 22:47:15
houhoujiayou(金币+1): 2012-01-02 14:11:26
是否是分泌型表达，是看你用的载体，而不是看宿主。你用的载体是分泌表达载体，没表达的原因很多，建议你好好看看毕赤酵母表达手册，先把基本问题搞清楚
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3楼2011-12-30 19:05:05
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liuyu_sdili

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
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wanhscn(金币+1): 热心 2011-12-31 14:37:26
wanhscn(金币+1): 热心 2011-12-31 14:37:35
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=4002082，写的很详细，自己下载来看吧
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5楼2011-12-31 11:11:19
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