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huichong

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
: Originally posted by fwks at 2012-01-07 10:58:08:
PCR的延伸时间够吗?看上去没有任何条带,似乎是没有扩增成功啊。普通的taq酶大概是每分钟1KB,如果是高保真的pfu酶速度会更低,你列一下自己的程序让大家看看。

程序是95度——3min
95度30s;56度30s;72度6min;——35cycles
72度10min
4度。。。
31楼2012-01-08 00:04:14
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fwks

铁杆木虫 (小有名气)


小丹木木(金币+1): 很有道理啊 2012-01-11 13:38:29
引用回帖:
31楼: Originally posted by huichong at 2012-01-08 00:04:14:
程序是95度——3min
95度30s;56度30s;72度6min;——35cycles
72度10min
4度。。。

你要扩增的条带是9kb,延伸时间才6min,有点短啊。建议你把延伸时间改到10min以上试试。
而且扩增这么长的片段,要用到专门的扩增长片段的酶,你用的哪家公司的?有时候如果长片段中GC含量偏高,PCR体系中还需要加其他的辅助试剂。
32楼2012-01-08 10:02:35
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fwks

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


huichong(金币+1): 2012-01-11 12:40:07
西瓜(金币+1): 欢迎交流 2012-01-11 15:22:07
引用回帖:
31楼: Originally posted by huichong at 2012-01-08 00:04:14:
程序是95度——3min
95度30s;56度30s;72度6min;——35cycles
72度10min
4度。。。

另外不知道引物特异性高不高,如果延伸时间延长后出现多条带,建议使用降落PCR再试一下。你问问你老师以前他扩增时候的体系和程序是什么,还有引物的Tm值也搞清楚。
33楼2012-01-08 10:07:13
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huichong

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
: Originally posted by fwks at 2012-01-08 10:02:35:
你要扩增的条带是9kb,延伸时间才6min,有点短啊。建议你把延伸时间改到10min以上试试。
而且扩增这么长的片段,要用到专门的扩增长片段的酶,你用的哪家公司的?有时候如果长片段中GC含量偏高,PCR体系中还需要 ...

用的是fermentas 的dream taq酶和pfu酶。还有是NEB公司的高保真酶。只有NEB这个酶说是能扩20k的,但是我做了做发现NEB的效果最不好。也不知道为什么
34楼2012-01-08 12:33:22
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huichong

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
: Originally posted by fwks at 2012-01-08 10:07:13:
另外不知道引物特异性高不高,如果延伸时间延长后出现多条带,建议使用降落PCR再试一下。你问问你老师以前他扩增时候的体系和程序是什么,还有引物的Tm值也搞清楚。

我这做的都是老师以前做过的体系和程序,但是我就是做不出来。谢谢你啊
35楼2012-01-08 12:35:13
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tengwan

新虫 (初入文坛)

6min对高保真酶,好像有点短。

换个普通taq酶先试试。

你检测过DNA模板没有?拿它跑个胶看看情况怎样?
36楼2012-01-10 17:15:21
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xinyingsmile

新虫 (初入文坛)


西瓜(金币+1): 欢迎新虫交流交流! 2012-01-11 15:22:28
可能是退火温度的问题
37楼2012-01-11 10:39:40
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xiao7270

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木(金币+1): 鼓励应助 2012-01-11 13:39:37
我也遇到过这种情况,当时是由于没注意,所用的引物与模板PCR产物的片段实际上是有出入的,不能完全匹配。所以,楼主还需要去对一下引物序列与模板序列。
38楼2012-01-11 11:41:56
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xiaoke2046

木虫 (知名作家)

等待正解,我也出现过这样的情况
39楼2012-01-12 01:06:32
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cai3110274

木虫 (职业作家)


西瓜(金币+1): 鼓励交流 2012-01-12 21:21:52
上样量多了点 稀释一下应该会好
夫天地者万物之逆旅
40楼2012-01-12 07:59:47
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