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huichong

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
: Originally posted by tengwan at 2011-12-31 02:57:30:
marker是多大?

好像胶不太好,没跑出点样孔呢,点样孔有东西要么就样品里有啥东西。

9kb的目标片段,marker应该也不小,但这marker的样子貌似比较小片段(?)

再制块胶,重新点样,这回样品点2个孔,有 ...

maker  是2000的,是小了。之前点样孔也没东西,后来就有了。好的我试试
21楼2011-12-31 11:10:28
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)

让一切随风飞翔

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): Good! 2011-12-31 22:09:08
引用回帖:
18楼: Originally posted by huichong at 2011-12-31 02:02:14:
呵呵,我的模板测得浓度是49ng/ul,我稀释10倍还是这样的,要是稀释1000倍的话会不会太稀。要求的大概也得2-10ng/ul啊??谢谢

要求的没那么高浓度,你说的1-10ng/ul可能指的是基因组DNA的浓度,因为某些基因在基因组中拷贝数较低,所以基因组作模板PCR需较高的浓度。
但你的实验中用的别人的PCR产物,条带不会很大,所以可以使用很低的模板浓度。
PS:我做载体构建的时候使用不同质粒做模板(大约7K-10K),浓度一般在10-50pg/ul(pg是ng的1/1000),也就是将小提的质粒稀释1000倍。
一直向前!
22楼2011-12-31 11:31:37
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根

引用回帖:
19楼: Originally posted by huichong at 2011-12-31 02:04:02:
我的模板很少也就几μ。所以每次加不敢多做。真是愁啊

体系按10个样配,但最后用只用1个
真相是最大的奢侈品
23楼2011-12-31 12:44:12
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瘟疫天使

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
做之前洗干净器材和材料,手机看不见图,但是之前我做的时候也遇到过类似的问题,希望对楼主有所帮助

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
24楼2011-12-31 13:48:49
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huichong

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
: Originally posted by zhangxn2010 at 2011-12-31 11:31:37:
要求的没那么高浓度,你说的1-10ng/ul可能指的是基因组DNA的浓度,因为某些基因在基因组中拷贝数较低,所以基因组作模板PCR需较高的浓度。
但你的实验中用的别人的PCR产物,条带不会很大,所以可以使用很低的模 ...

好的,太感谢了。我再做做试试
25楼2011-12-31 22:54:54
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huichong

铁虫 (初入文坛)


小丹木木(金币+1): 不要灰心啊,继续努力 2012-01-04 08:53:52
我发现我太对不起各位的谆谆教导了。这是我把模板稀释了100倍跟1000倍的图片,发现跟以前是一样的。。。。。失败

最右边是maker,前四道是一种酶,后四道是另一种酶。都不行啊

26楼2012-01-04 00:51:29
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lw19850128

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你这个应该是没有P出来
27楼2012-01-04 14:26:26
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tengwan

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


小丹木木(金币+1): 鼓励新虫积极应助哦 2012-01-11 13:37:28
目标片段要多长。

这个看着应该是引物不行。要么设计不行,要么合成质量不行。一般这种只有smear连个模糊条带样子都木有的,引物出问题可能性大。当然,要确保你的操作都没问题。

要不,找你们老师要他当年的引物,来做个对照p看看,还是你就是在用他当年的引物?
28楼2012-01-06 23:42:47
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huichong

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
: Originally posted by tengwan at 2012-01-06 23:42:47:
目标片段要多长。

这个看着应该是引物不行。要么设计不行,要么合成质量不行。一般这种只有smear连个模糊条带样子都木有的,引物出问题可能性大。当然,要确保你的操作都没问题。

要不,找你们老师要他当年 ...

目的片段9kb,引物是老师用过的,拿序列让生工合成的。
29楼2012-01-07 01:35:36
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fwks

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
PCR的延伸时间够吗?看上去没有任何条带,似乎是没有扩增成功啊。普通的taq酶大概是每分钟1KB,如果是高保真的pfu酶速度会更低,你列一下自己的程序让大家看看。
30楼2012-01-07 10:58:08
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