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huichong

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by tengwan at 2011-12-31 02:57:30:
marker是多大？

好像胶不太好，没跑出点样孔呢，点样孔有东西要么就样品里有啥东西。

9kb的目标片段，marker应该也不小，但这marker的样子貌似比较小片段（？）

再制块胶，重新点样，这回样品点2个孔，有 ...

maker  是2000的，是小了。之前点样孔也没东西，后来就有了。好的我试试
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21楼2011-12-31 11:10:28
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)

让一切随风飞翔

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): Good！ 2011-12-31 22:09:08
引用回帖:
18楼: Originally posted by huichong at 2011-12-31 02:02:14:
呵呵，我的模板测得浓度是49ng/ul，我稀释10倍还是这样的，要是稀释1000倍的话会不会太稀。要求的大概也得2-10ng/ul啊？？谢谢

要求的没那么高浓度，你说的1-10ng/ul可能指的是基因组DNA的浓度，因为某些基因在基因组中拷贝数较低，所以基因组作模板PCR需较高的浓度。
但你的实验中用的别人的PCR产物，条带不会很大，所以可以使用很低的模板浓度。
PS：我做载体构建的时候使用不同质粒做模板（大约7K-10K），浓度一般在10-50pg/ul（pg是ng的1/1000）,也就是将小提的质粒稀释1000倍。
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一直向前！
22楼2011-12-31 11:31:37
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根
引用回帖:
19楼: Originally posted by huichong at 2011-12-31 02:04:02:
我的模板很少也就几μ。所以每次加不敢多做。真是愁啊

体系按10个样配，但最后用只用1个
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真相是最大的奢侈品
23楼2011-12-31 12:44:12
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瘟疫天使

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
做之前洗干净器材和材料，手机看不见图，但是之前我做的时候也遇到过类似的问题，希望对楼主有所帮助

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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24楼2011-12-31 13:48:49
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huichong

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by zhangxn2010 at 2011-12-31 11:31:37:
要求的没那么高浓度，你说的1-10ng/ul可能指的是基因组DNA的浓度，因为某些基因在基因组中拷贝数较低，所以基因组作模板PCR需较高的浓度。
但你的实验中用的别人的PCR产物，条带不会很大，所以可以使用很低的模 ...

好的，太感谢了。我再做做试试
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25楼2011-12-31 22:54:54
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huichong

铁虫 (初入文坛)
★
小丹木木(金币+1): 不要灰心啊，继续努力 2012-01-04 08:53:52
我发现我太对不起各位的谆谆教导了。这是我把模板稀释了100倍跟1000倍的图片，发现跟以前是一样的。。。。。失败

最右边是maker，前四道是一种酶，后四道是另一种酶。都不行啊
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26楼2012-01-04 00:51:29
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lw19850128

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你这个应该是没有P出来
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27楼2012-01-04 14:26:26
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tengwan

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
小丹木木(金币+1): 鼓励新虫积极应助哦 2012-01-11 13:37:28
目标片段要多长。

这个看着应该是引物不行。要么设计不行，要么合成质量不行。一般这种只有smear连个模糊条带样子都木有的，引物出问题可能性大。当然，要确保你的操作都没问题。

要不，找你们老师要他当年的引物，来做个对照p看看，还是你就是在用他当年的引物？
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28楼2012-01-06 23:42:47
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huichong

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by tengwan at 2012-01-06 23:42:47:
目标片段要多长。

这个看着应该是引物不行。要么设计不行，要么合成质量不行。一般这种只有smear连个模糊条带样子都木有的，引物出问题可能性大。当然，要确保你的操作都没问题。

要不，找你们老师要他当年 ...

目的片段9kb，引物是老师用过的，拿序列让生工合成的。
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29楼2012-01-07 01:35:36
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fwks

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR的延伸时间够吗？看上去没有任何条带，似乎是没有扩增成功啊。普通的taq酶大概是每分钟1KB，如果是高保真的pfu酶速度会更低，你列一下自己的程序让大家看看。
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30楼2012-01-07 10:58:08
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