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BIO-che

新虫 (小有名气)

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[求助] 蛋白质纯化凝胶层析

我准备用凝胶层析的方法来纯化目标蛋白，计划要用S-200，不知上样时，要一次至少要上多少毫克的蛋白质溶液才行？多少毫升？每毫升多少毫克？
同时想问一下，S-200装柱时一定要一次性全装上才行吗？我的实验室是没有泵的，只能手工装？
蛋白质溶液是不是一定要垂直加入胶上？那么缓冲液也要直加入胶上吗？还有加入液体的上管道最远能够离胶面多远？如果胶上表面积水过多，会不会影响结果？

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1楼 2011-12-07 23:31:43

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acehanhan

金虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+5): Good!说得很细致了！ 2011-12-11 17:52:44

在一定的上样量中，蛋白质的浓度高点好，没有具体要求，因为分子筛有对样品会有稀释作用。样品浓度低的话层析后更低。
上样前要让缓冲液刚刚流入凝胶，表面保留一点点（不能让胶进入空气），关闭开关；
将样品液用滴灌缓缓加入柱中，打开开关，让样品溶液也是刚刚进入柱中（柱表面也是保留一点点），关闭开关；
再缓缓加入洗脱液覆盖凝胶表面，然后接上洗脱液进行洗脱。
整个操作过程液体表面不能低于凝胶柱的表面。柱头及整个柱子在层析过程中均为垂直。