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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 连接转化进大肠杆菌BL21
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shuifen1108

金虫 (正式写手)

[求助] 连接转化进大肠杆菌BL21

做完PCR，从T载体提取质粒，酶切连接pet载体，转化BL21，涂AMP板子是能够生长的，但是提取质粒酶切就是鉴定不出来，为什么呢？如果不是转化成功了，在amp平板上应该是不能生长的吧，可能是哪些原因导致的结果，请指教
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1楼 2011-11-23 13:05:34
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gaojuan1985

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
shuifen1108: 金币+1, 谢谢 2013-03-04 13:51:41
1. 我们实验室出现过T载体污染的现象。连到pET载体上之后转化，然后长出的克隆提质粒酶切发现大小不对，最后发现都是T载体。
2. 假阳性，所以要注意连接体系中insert和vertor的比例问题，还有就是把vector进行一下碱性磷酸酶处理，减少假阳性。
3. 所谓的鉴定不出来是什么意思？酶切切不开还是根本就提不出质粒？还是质粒自连？如果是能提出质粒但是切不开，有没有可能被甲基化酶修饰了？我们以前也碰到这种情况的。用一个酶就是切不开，后来发现在大肠杆菌中质粒扩增时，那个位点被甲基化了。
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7楼2013-03-01 17:17:02
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jycloud

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

如果酶切不彻底，pet空载体是可以在Amp板子上生长的，建议：
1、酶切pet载体后电泳回收切开的质粒，最好是双酶切
2、Amp的浓度加大一点，如：从50加大到100
3、多挑取几个菌落鉴定，一般短时间就长出大菌落的是没有外源片段的，小一些的菌落概率比较大，但是卫星菌落不要挑
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猫猫
2楼2011-11-23 13:18:16
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shuifen1108

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jycloud at 2011-11-23 13:18:16:
如果酶切不彻底，pet空载体是可以在Amp板子上生长的，建议：
1、酶切pet载体后电泳回收切开的质粒，最好是双酶切
2、Amp的浓度加大一点，如：从50加大到100
3、多挑取几个菌落鉴定，一般短时间就长出大菌落的是 ...

pet载体和目标片段都是经过酶切  ，电泳 ， 回收纯化的，可以确定连接所用的东西是纯净的
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3楼2011-11-23 14:39:17
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jingdejun

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
linyingjia(金币+1): 有道理 2011-11-23 19:55:57
shuifen1108(金币+2): 2011-11-24 21:18:01
提供一个思考的方向，能在AMP板子上长出来的也不一定是阳性的。
不信的话，你就挑这些菌落液体培养（加AMP抗性），有些菌就不会长。

之所以会在板子上长出来，最大的可能性就是培养时间过长导致的。

做完转化的板子放在4度冰箱，原本的小菌落会变大，原本没有菌落的地方也可能会长出来一些单菌落，就是差不多的原因。

最好的话就是重新做吧。有时候不要问那么多的原因，重做说不定就会一次成功，特别是做分子的。

希望对楼主有所帮助。最后祝实验顺利。
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4楼2011-11-23 16:39:28
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