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pitty595铜虫 (小有名气)
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[求助]
cDNA PCR 产物异常大
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cDNA样品，以特异性引物PCR, 结果出了目的条带（e.g., 200bp）外，还有很大的一条带（>5kb to 12kb），而且并不是非常集中的电泳条带，有一定的拖尾，但是目的条带不拖尾，很集中的一条。但奇怪的是并不是所有的cDNA样品都会有这条诡异的大片段，有那么1-2个样品中没有，只有正常的目的产物条带。 可能性： 1，引物不特异。但是为什么有的正常？而且基因组DNA的阳性对照中，也没有这条巨大的条带。另外，通过提升退火温度（55到62度）也没有变化。貌似可以排除引物的原因。 2，基因组DNA污染，DNase处理时不完全。但RNA经过DNASE处理后，PCR显示为阴性，无扩增产物；另外，基因组DNA的阳性对照中，也没有这条巨大的条带。貌似也可以排除该可能性。 3，模板浓度过高。为了排除这种可能，我做了梯度稀释，1：10，1：50，1：100，结果并没有让这条鬼带消失，只是变淡了，但是目的条带也相应变淡了，而且还多出来几条<1000bp的非特异条带。 4，其他可能性？希望大家帮帮我，到底是怎么回事？多谢！ |
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