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H-xiangzhu

金虫 (正式写手)

[求助] 微生物胞内物质与胞外代谢产物提取

我要提取微生物胞内和胞外代谢产物，要去除杂蛋白质和菌体等，离心沉淀后，
1、上清液我加入草酸沉淀，后面加入丙酮溶解后离心去沉淀，请问丙酮我怎么去除呢？
2、对于胞内蛋白，我加入无水乙醇超声波破碎，后面离心去除沉淀，可是我的上清液中有无水乙醇，请问用什么方法可以把无水乙醇去除呢？

补充：1、我试验样品很少，就只有小几ml这样
      2、我们实验室只有真空泵，没有旋转蒸发仪和吹氮仪
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1楼 2011-11-07 12:03:54
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HarveyWang

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海外行者

【答案】应助回帖

★ ★ ★
zhang8826857(金币+3): good，看lz的反馈，lz反馈好可以向版主申请个EPI啊^_^ 2011-11-07 14:14:07
H-xiangzhu(金币+1): 2011-11-07 15:23:40
1.我一般就是放在通风橱几个小时，丙酮很快就挥发完了。剩余的主要是水分溶液。
乙醇的较难挥发，几个小时后放在40摄氏度的抽真空的恒温箱中，大约一个小时可以抽完剩余水分。

2.注意事项！
这时候要注意，你到底是测什么？！！
例如你要是测定发酵液的乙酸，肯定是要再抽之前加6M NaOH少许，将溶液变碱。因为在酸性条件下，乙酸在最后快抽干的时候要挥发的!

3.无论是丙酮还是乙醇，除蛋白的效果走不足以立即上液相柱子。其中会有不少的蛋白残留。即使是使用80%以上的乙醇。不信，你可以拿BSA蛋白做下测试，看看跟三氯乙酸相比，能不能有多少蛋白沉淀。

但是，这一步中有一个很好的去处蛋白的方法。就是最后的干燥抽真空步骤。当接近干燥的时候，所有的细胞蛋白都回变性沉淀的！

就是说，对于干燥抽干的样品，你只要用水溶液溶解，然后10000 rpm离心5-10分钟，上清中就几乎没有蛋白了。

细胞蛋白都回变成一团沉在管子的底部。上清你可以直接上样过柱子。
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H-xiangzhu
【我一直认为做土匪很性感很坏，很直接，可以大声喊：JCMM我爱你！所以，我自从博士毕业后，就一直在寻找黑道大哥一起去抢钱、抢粮、抢地盘】
4楼2011-11-07 14:10:46
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HarveyWang

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海外行者

【答案】应助回帖

★ ★
zhang8826857(金币+2): 鼓励应助 2011-11-11 11:29:53
楼主MM，还有其他的几个小技巧，哥都一块儿告诉你。

1.样品几毫升足够啦。用那种 5mL的EP管，将丙酮或乙醇用抽风机抽去还剩下大约 1ml的时候，里面主要的就是水分啦，再难风干啦。。。这时就换成抽真空恒温箱。

恒温箱可以开到40-50摄氏度，对于小分子的代谢物一般不会变质的。

2.在抽真空的时候，一定要将EP管的盖子完全打开，然后慢慢抽，因为可能会出现爆沸，将你的样品都冲出来。所以这时候你要自己摸索一下抽的条件哈~~
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5楼2011-11-07 14:19:23
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HarveyWang

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海外行者
刚看了下，这么专业的问题，你才一个金币哈。。。幸亏哥不缺钱
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6楼2011-11-07 14:22:56
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HarveyWang

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海外行者
引用回帖:
10楼: Originally posted by H-xiangzhu at 2011-11-10 14:56:44:
你好！我有个疑问哈，比较白痴的，就是我的样品放通风橱里面会不会有污染的可能呢、？

你到底测什么？
测定酸类物质，就两个小时，应该没事哈。

不过这要看你的实验室到底有多脏？要是飞进去一个苍蝇也是有可能的
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【我一直认为做土匪很性感很坏，很直接，可以大声喊：JCMM我爱你！所以，我自从博士毕业后，就一直在寻找黑道大哥一起去抢钱、抢粮、抢地盘】
11楼2011-11-10 15:15:47
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HarveyWang

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★
zhang8826857(金币+1): 鼓励交流 2011-11-14 09:21:22
引用回帖:
12楼: Originally posted by H-xiangzhu at 2011-11-11 09:46:28:
我的是放线菌发酵液，我要测杀虫活性物质，然后确定是胞内还是胞外的，是大分子还是小分子物质。

原来这样啊。先看有没有，根本不用向代谢组学一样麻烦。
步骤如下：

1.测定胞外的活性物质：

用灭菌的EP管，无菌取样，然后10000rpm 离心5min，什么放线菌或细菌都会沉下去，然后用无菌的1% NaCl稀释发酵离心上清液一系列浓度。然后做抑菌圈实验。


2.胞内的活性物质：
由于不能确定是溶于有机溶剂的还是水溶性的。故拿细胞破碎液来做。
取菌丝沉淀，用无菌的1% NaCl清洗两遍，以洗掉发酵液。
离心沉淀菌丝体，然后用1% NaCl超声破碎，此时菌丝体越浓越好。

破碎液分为两份：
A份用1% NaCl稀释一下，然后10000rpm 离心20min，上清液用无菌的NaCl稀释一系列梯度，做抑菌圈实验。

B份用有机溶剂，例如无水乙醇或丙酮等萃取，然后蒸干或风干（步骤见前面我说的）。最好用丙酮来做，丙酮容易蒸掉。最后的干燥物用灭菌的1% NaCl稀释一下，做抑菌圈实验。


3.抑菌圈实验：
在平板上涂目的细菌，例如八叠球菌或葡萄球菌等。
用那种灭菌的不锈钢筒（内径大约为4mm，高度大约为1cm，没有底）扣在此平板上。
每个平板可以扣4-8个。
然后向圈内加20uL或50uL的上面的抑菌物质稀释液。
用卡那霉素或青霉素做阳性对照。
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H-xiangzhu
【我一直认为做土匪很性感很坏，很直接，可以大声喊：JCMM我爱你！所以，我自从博士毕业后，就一直在寻找黑道大哥一起去抢钱、抢粮、抢地盘】
13楼2011-11-11 19:00:37
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HarveyWang

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引用回帖:
15楼: Originally posted by H-xiangzhu at 2011-12-16 13:40:09:
你好！由于我样品比较多，每次都要超声破碎的话很费时费力，请问我能否用甲醇浸泡呢？浸泡完是不是要去甲醇然后用丙酮等有机溶剂进行处理？

直接用丙酮浸泡说不定也行。
振荡浸泡一晚，看看菌体碎了就行。
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16楼2011-12-16 15:12:02
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HarveyWang

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scelab(金币+3): 谢谢热心回复哦~ 2011-12-17 02:31:57
引用回帖:
17楼: Originally posted by H-xiangzhu at 2011-12-16 23:46:19:
嗯那后面有机溶剂浓缩挥发直接用于生测就可以的吧？

如果丙酮的话，可以挥发很快。
直接生测，要稀释很多倍吧？用无菌水。
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18楼2011-12-17 02:22:46
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