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H-xiangzhu金虫 (正式写手)
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微生物胞内物质与胞外代谢产物提取
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我要提取微生物胞内和胞外代谢产物，要去除杂蛋白质和菌体等，离心沉淀后， 1、上清液我加入草酸沉淀，后面加入丙酮溶解后离心去沉淀，请问丙酮我怎么去除呢？ 2、对于胞内蛋白，我加入无水乙醇超声波破碎，后面离心去除沉淀，可是我的上清液中有无水乙醇，请问用什么方法可以把无水乙醇去除呢？ 补充：1、我试验样品很少，就只有小几ml这样 2、我们实验室只有真空泵，没有旋转蒸发仪和吹氮仪 |
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HarveyWang
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zhang8826857(金币+1): 鼓励交流 2011-11-14 09:21:22
zhang8826857(金币+1): 鼓励交流 2011-11-14 09:21:22
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原来这样啊。先看有没有，根本不用向代谢组学一样麻烦。 步骤如下： 1.测定胞外的活性物质： 用灭菌的EP管，无菌取样，然后10000rpm 离心5min，什么放线菌或细菌都会沉下去，然后用无菌的1% NaCl稀释发酵离心上清液一系列浓度。然后做抑菌圈实验。 2.胞内的活性物质： 由于不能确定是溶于有机溶剂的还是水溶性的。故拿细胞破碎液来做。 取菌丝沉淀，用无菌的1% NaCl清洗两遍，以洗掉发酵液。 离心沉淀菌丝体，然后用1% NaCl超声破碎，此时菌丝体越浓越好。 破碎液分为两份： A份用1% NaCl稀释一下，然后10000rpm 离心20min，上清液用无菌的NaCl稀释一系列梯度，做抑菌圈实验。 B份用有机溶剂，例如无水乙醇或丙酮等萃取，然后蒸干或风干（步骤见前面我说的）。最好用丙酮来做，丙酮容易蒸掉。最后的干燥物用灭菌的1% NaCl稀释一下，做抑菌圈实验。 3.抑菌圈实验： 在平板上涂目的细菌，例如八叠球菌或葡萄球菌等。 用那种灭菌的不锈钢筒（内径大约为4mm，高度大约为1cm，没有底）扣在此平板上。 每个平板可以扣4-8个。 然后向圈内加20uL或50uL的上面的抑菌物质稀释液。 用卡那霉素或青霉素做阳性对照。 |
H-xiangzhu13楼2011-11-11 19:00:37
2楼2011-11-07 13:02:19
H-xiangzhu
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3楼2011-11-07 13:56:38
HarveyWang
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【答案】应助回帖
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zhang8826857(金币+3): good，看lz的反馈，lz反馈好可以向版主申请个EPI啊^_^ 2011-11-07 14:14:07
H-xiangzhu(金币+1): 2011-11-07 15:23:40
zhang8826857(金币+3): good，看lz的反馈，lz反馈好可以向版主申请个EPI啊^_^ 2011-11-07 14:14:07
H-xiangzhu(金币+1): 2011-11-07 15:23:40
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1.我一般就是放在通风橱几个小时，丙酮很快就挥发完了。剩余的主要是水分溶液。 乙醇的较难挥发，几个小时后放在40摄氏度的抽真空的恒温箱中，大约一个小时可以抽完剩余水分。 2.注意事项！ 这时候要注意，你到底是测什么？！！ 例如你要是测定发酵液的乙酸，肯定是要再抽之前加6M NaOH少许，将溶液变碱。因为在酸性条件下，乙酸在最后快抽干的时候要挥发的! 3.无论是丙酮还是乙醇，除蛋白的效果走不足以立即上液相柱子。其中会有不少的蛋白残留。即使是使用80%以上的乙醇。不信，你可以拿BSA蛋白做下测试，看看跟三氯乙酸相比，能不能有多少蛋白沉淀。 但是，这一步中有一个很好的去处蛋白的方法。就是最后的干燥抽真空步骤。当接近干燥的时候，所有的细胞蛋白都回变性沉淀的！ 就是说，对于干燥抽干的样品，你只要用水溶液溶解，然后10000 rpm离心5-10分钟，上清中就几乎没有蛋白了。 细胞蛋白都回变成一团沉在管子的底部。上清你可以直接上样过柱子。 |
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4楼2011-11-07 14:10:46
