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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 连接酶切问题
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上官譞

新虫 (初入文坛)

[求助] 连接酶切问题

我用SwaⅠ酶切载体，然后连接GFP，酶切连接一起做，25度一小时，可是总是连不上，有做过的帮分析一下吗，谢谢
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1楼 2011-10-16 19:14:44
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linyingjia

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
看天(金币+1): 鼓励交流 2011-10-17 11:19:02
位点选的对吗   酶切、连接反应条件对吗    东西没过期？
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2楼2011-10-16 19:37:42
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怎么都行

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
看天(金币+1): 鼓励 2011-10-17 11:18:53
酶切连接一起做是什么意思，两步同时进行？
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3楼2011-10-17 02:01:59
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上官譞

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by linyingjia at 2011-10-16 19:37:42:
位点选的对吗   酶切、连接反应条件对吗    东西没过期？

平头末端连接，和位点选择相关吗，我现在就是有点怀疑连接的条件，以前有人做过，成功了，但是我自己做就是连不上，已经做了很多次，根据电泳图看，似乎是载体连在一起了，我也是刚刚开始做实验。。。
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4楼2011-10-17 08:05:40
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上官譞

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 怎么都行 at 2011-10-17 02:01:59:
酶切连接一起做是什么意思，两步同时进行？

是的，酶切和连接同时进行，在一个体系内
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5楼2011-10-17 08:06:26
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luoyang87

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

酶切连接能在一个体系做吗？
内切酶和连接酶的BUFFER不一样，会有影响的，即使没影响，这边刚连上那边又切开……
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6楼2011-10-17 12:51:56
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上官譞

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by luoyang87 at 2011-10-17 12:51:56:
酶切连接能在一个体系做吗？
内切酶和连接酶的BUFFER不一样，会有影响的，即使没影响，这边刚连上那边又切开……

可以的，应经做过了，不用内切酶的buffer,SwaⅠ酶有个特点，连接成功后，不会在原来连接的位点再切开，所以不会担心连接成功再被切开。。。
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7楼2011-10-17 15:08:04
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luoyang87

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 上官譞 at 2011-10-17 15:08:04:
可以的，应经做过了，不用内切酶的buffer,SwaⅠ酶有个特点，连接成功后，不会在原来连接的位点再切开，所以不会担心连接成功再被切开。。。

你做的太高端了，没接触过，我觉得既然没发重现之前的结果，不妨稳妥点，酶切连接分开进行
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8楼2011-10-17 15:12:29
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keennes

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
lstt09nk(金币+2): 感谢参与，欢迎交流 2011-10-17 22:26:08
调整一下你的“插入片段”和载体片段的分子数量之比！
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独上高楼，望尽天涯路……
9楼2011-10-17 19:53:29
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上官譞

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by luoyang87 at 2011-10-17 15:12:29:
你做的太高端了，没接触过，我觉得既然没发重现之前的结果，不妨稳妥点，酶切连接分开进行

嗯，我现在是分开做了，再看看结果
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10楼2011-10-18 16:01:52
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