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小丫的维尼熊

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[交流] DNA限制性内切酶酶切反应

1.  底物DNA没有被所用限制酶切断，为什么?
1.1  底物DNA上没有该限制酶的识别、切断位点。特别是一些经过重组等处理的DNA，碱基易发生缺失、变化等。
1.2  限制酶识别位点上的A或C被甲基化。
部分限制酶对识别位点中的碱基是否被甲基化比较敏感，从而无法切断该位点。被甲基化的部位，根据底物DNA及宿主种类的不同而不同。
大多数大肠杆菌都带有2种具有特异性识别位点的甲基化酶，即dam methylase (G6mATC) 和dcm methylase (C5mCWGG)。在进行转化时，通常使用的菌株为C600、HB101、JM109等，因为都带有dam、dcm甲基化酶，所以使用这些菌株制备的DNA时，必须注意。另外，动物由来的DNA，CG序列多为5mCG；植物由来的DNA，CG及CNG序列多为5mCG和5mCNG。
1.3  底物不纯。
如果底物DNA中含有限制酶阻害物质，会影响限制酶的酶切作用。在此种情况下，底物DNA须重新进行纯化。
1.4  底物DNA种类不同，它们的大小，切点数也不同, 达到完全分解时, 所需要的酶量也不同, 从这些数据中计算出的 [完全分解1 mg DNA所需要的限制酶预计量] 与 [实际量]，也因限制酶的种类不同而有差别，这些差别被认为是酶同其识别位点周围的高级结构亲和程度而产生的。例如, 限制酶Nae I 在切断pBR322 DNA时, 就有着非常难以切断的部位。
1.5  Star活性（星号活性）
限制酶在一些特定条件下使用时，对于底物DNA的特异性可能降低。即可以把与原来识别的特定的DNA序列不同的碱基序列切断，这个现象叫Star活性。Star活性出现的频率，根据酶、底物DNA、反应条件的不同而不同，可以说几乎所有的限制酶都具有Star活性。并且，它们除了识别序列的范围增大之外，还发现了在DNA的一条链上加入切口的单链切口活性，所以为了极力抑制Star活性，一般情况下，即使会降低反应性能，也提倡在低甘油浓度、中性pH、高盐浓度条件下进行反应。
45DNA限制性内切酶酶切反应怎样确认酶切位点是否被甲基化?
一般情况下，从大多数的大肠杆菌中提取的DNA，几乎都存在被甲基化的现象，其相对应识别序列的受甲基化影响的限制酶即切不开该酶切位点。而只有在转化时选用了甲基化酶欠损的大肠杆菌作为宿主，提取的DNA才不会被甲基化。在实际操作中，如果使用受甲基化酶影响的限制酶对从一般的大肠杆菌中提取的DNA进行酶切反应，而没切开，或者对测序结果有酶切位点的片段，切不开，其酶切位点被甲基化的可能性就比较大，这时就要选用不受甲基化影响的限制酶进行酶切。

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