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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 转基因 » 转基因问题
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XI4ZHL

铜虫 (著名写手)

[求助] 转基因问题

各位大虾，我想做转基因，可是我转的基因在小鼠中本来就有，我应该如何确定后代中有没有转成功？是原来的，还是我转进去的？？求各位大虾帮忙，不胜感激！！
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心，是用来使用的，不能搁浅！
1楼 2011-09-04 16:11:13
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世外清风

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

XI4ZHL(金币+2): 谢谢你 2011-09-07 08:14:45
启动子什么的特异吗？或看看里面有没有其他一段和基因组内不同的序列进行扩增即可。
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2楼2011-09-06 08:13:56
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XI4ZHL

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 世外清风 at 2011-09-06 08:13:56:
启动子什么的特异吗？或看看里面有没有其他一段和基因组内不同的序列进行扩增即可。

我不用启动子，直接用基因序列cds区做可以吗？基因和小鼠的同源性很高，我把质粒上加上荧光蛋白再转可以吗？这样可以检测后代中是否有光蛋白，有的说明转成功，再做这个基因的定量可以吗？？大虾，希望达到你的帮助，谢谢！
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心，是用来使用的，不能搁浅！
3楼2011-09-06 08:37:42
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世外清风

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

没启动子当然不行了.根本启动不了...你是连到什么载体上，是不是载体上已经有CMV启动子了，你扩一段载体上的序列应该也可以吧，之后做做定量看看有没有过表达是可以的
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4楼2011-09-06 14:09:03
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XI4ZHL

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 世外清风 at 2011-09-06 14:09:03:
没启动子当然不行了.根本启动不了...你是连到什么载体上，是不是载体上已经有CMV启动子了，你扩一段载体上的序列应该也可以吧，之后做做定量看看有没有过表达是可以的

我还没开始，万一思路错了，就都白干！载体还没选好，我想选一个带荧光蛋白的载体重新构建，以前师姐构建了一个载体pcDNA3.1，上边有pCMV，下游是目的基因，我不知能用吗。我现在不明白的关键问题是，转完之后，在小鼠后代中，不可能所有的都转成功（想用打点注射），我现在弄不明白，如何鉴定后代中那个是有目的基因，哪些后代是正常小鼠，如果我用带荧光蛋白的载体，是不是可以检测一下后代的荧光蛋白，从而区分哪些有目的基因，哪些没有，大虾，你看可以吗？谢谢大虾，我是新手，不懂请大虾给指点一下！谢谢
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心，是用来使用的，不能搁浅！
5楼2011-09-07 08:14:15
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世外清风

铁杆木虫 (职业作家)
其实有没有荧光无所谓，有荧光的话可能更直观点，有没有成功转入直接用PCR就可以了，pc3.1可以的，因为在老鼠基因组内是没有CMV的，CMV和你的目的基因是连在一起的，PCR检测到CMV转入了，就可以判定你外源的目的基因也转入了，一般在PCR成阳性后，一般要进一步用Southern验证的，如也为阳性那么基本就可以判定了。当然你是不是完整的整合进入也可以用PCR和Southern检测出来.但转入了并不一定表达，因为基因组内部很复杂，这就要看你的人品了，做个定量看看mRNA水平上有没有过表达，可以初步判定一下。
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6楼2011-09-07 08:25:32
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世外清风

铁杆木虫 (职业作家)
先要设计好是应该的
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7楼2011-09-07 08:25:59
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XI4ZHL

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 世外清风 at 2011-09-07 08:25:32:
其实有没有荧光无所谓，有荧光的话可能更直观点，有没有成功转入直接用PCR就可以了，pc3.1可以的，因为在老鼠基因组内是没有CMV的，CMV和你的目的基因是连在一起的，PCR检测到CMV转入了，就可以判定你外源的目的基 ...

那CMV用pcr检测，使用通用的测序引物检测，还是自己设计的目的基因的引物检测，谢谢
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心，是用来使用的，不能搁浅！
8楼2011-09-07 09:27:02
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)
你这都还没开始做啊，转基因肯定是要用启动子的，不管是CMV还是特异性启动子。至于最终确定是否转基因动物，首先要在细胞水平验证，筛选出单克隆做个RT-PCR看看，有条件可以做做SOUTHERN，然后转完生下小鼠再重复这些检测，当然你也可以做做FISH和反向PCR来看整合位点。这其实是一个复杂的过程，做好完整的转基因动物检测就是一篇博士论文。常用的手段  PCR、southern、FISH、反向PCR.就算后面两个不做，前两个也要做一做。
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9楼2011-09-07 10:00:37
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XI4ZHL

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by huguangdong at 2011-09-07 10:00:37:
你这都还没开始做啊，转基因肯定是要用启动子的，不管是CMV还是特异性启动子。至于最终确定是否转基因动物，首先要在细胞水平验证，筛选出单克隆做个RT-PCR看看，有条件可以做做SOUTHERN，然后转完生下小鼠再重复 ...

是啊，我只是验证一下以前师姐构建的载体，别的还没开始，先把能想到的问题想清楚了，再做。你说的稳定表达，RT-PCR我都知道，关键是，我设计的引物是基因全长的，，那我用pcr检测时，克隆出来的是基因全长，那CMV启动子怎么确定有，关键是转到小鼠之后，小鼠中本来也有和目的基因相同的基因，所以在小鼠后代中，怎么检测cmv启动子的存在，这个有了，才能确定转基因成功，再做定量之类的进行比较，我是新手，刚开始，还要麻烦你，谢谢（我的关键问题是如何在后代中确定那个是转成功的，那个是没有啊，你说cmv小鼠中没有，那我想检测到cmv不就说明成功了，那就是要检测cmv了，那cmv怎么检测）谢谢，有点罗嗦，见谅了大虾！！
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心，是用来使用的，不能搁浅！
10楼2011-09-07 10:57:10
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