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jb1003

新虫 (初入文坛)

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[交流] 药用植物麦冬ITS序列的扩增？

药用植物麦冬ITS序列的扩增，请高手指点一下，我扩了一两个月都没能稳定的扩出来。ITS序列的扩增引物分别为位于18S上ITS5(5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3)和位于26S上的ITS4(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)。PCR反应体系25μL总体积中，含有10×PCR buffer （上海生工）2.5μL；25mmol/L MgCl2 （上海生工）1.5μL；10 mmol/L dNTP mixture（上海生工） 0.5μL；10μmol/L引物各1.5μL；5 U/μL Taq DNA酶（上海生工）0.3μL；DNA模板3.0μL（约100ng）。扩增反应程序：95℃预变性4 min，95℃变性50 sec，50℃退火50 sec，72℃延伸90 sec，共35个循环，72℃延伸7 min，4℃保温。在那方面可能有问题呢？需做如何改进。谢谢。。凝胶电泳图见附件。

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1楼 2011-08-31 13:35:18

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瓶儿花

金虫 (小有名气)

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★ ★ ★ ★
jb1003(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+3): good 2011-08-31 17:06:25

我做的PCR反应体系是这样的，你可以参考一下：50μL反应体系
10×PCR Buffer 5μL
Mgcl2             3μL
dNTPs             4μL
10μmol/L引物各0.5μL
5U/μL rTaq       0.5μL
DNA模板    0.5μL
PCR扩增反应程序：
95℃预变性3min；
95℃变性1min；
55℃退火1min；
72℃延伸90s；30个循环；
72℃延伸8min，4℃保存。
根据你的反应体系来看，可能是DNA模板浓度太高，适当把模板浓度降低一点，我曾经也是这样，高浓度模板是P不出来的，后来稀释了50倍，电泳检测条带是很亮的。你可以试试看。另外，循环次数过多非特性会增多的，退火温度太低，非特异性也就多了。

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