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药用植物麦冬ITS序列的扩增？
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| 药用植物麦冬ITS序列的扩增，请高手指点一下，我扩了一两个月都没能稳定的扩出来。ITS序列的扩增引物分别为位于18S上ITS5(5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3)和位于26S上的ITS4(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)。PCR反应体系25μL总体积中，含有10×PCR buffer （上海生工）2.5μL；25mmol/L MgCl2 （上海生工）1.5μL；10 mmol/L dNTP mixture（上海生工） 0.5μL；10μmol/L引物各1.5μL；5 U/μL Taq DNA酶（上海生工）0.3μL；DNA模板3.0μL（约100ng）。扩增反应程序：95℃预变性4 min，95℃变性50 sec，50℃退火50 sec，72℃延伸90 sec，共35个循环，72℃延伸7 min，4℃保温。在那方面可能有问题呢？需做如何改进。谢谢。。凝胶电泳图见附件。 |
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jb1003(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+3): good 2011-08-31 17:06:25
jb1003(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+3): good 2011-08-31 17:06:25
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我做的PCR反应体系是这样的，你可以参考一下：50μL反应体系 10×PCR Buffer 5μL Mgcl2 3μL dNTPs 4μL 10μmol/L引物 各0.5μL 5U/μL rTaq 0.5μL DNA模板 0.5μL PCR扩增反应程序： 95℃预变性3min； 95℃变性1min； 55℃退火1min； 72℃延伸90s；30个循环； 72℃延伸8min，4℃保存。 根据你的反应体系来看，可能是DNA模板浓度太高，适当把模板浓度降低一点，我曾经也是这样，高浓度模板是P不出来的，后来稀释了50倍，电泳检测条带是很亮的。你可以试试看。另外，循环次数过多非特性会增多的，退火温度太低，非特异性也就多了。 |
2楼2011-08-31 14:33:38