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wzhgaochuan新虫 (小有名气)
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目的基因连接pGEX-6p-1进行转化的问题
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我想要用大肠杆菌来表达目的蛋白，在构建到T载上并测序正确之后，想构建到表达载体pGEX-6p-1上，空载体和目的基因双酶切后电泳回收，条带位置都正确，我的目的基因是900bp。在连接转化DH5a后涂平板，菌斑也长出来了，但挑菌摇菌提质粒后进行双酶切鉴定时发现条带跑的乱七八糟的，无论是载体还是目的基因位置都不对，我做了3次都是这样，也找不出原因，想请教一下高人这是为什么啊？问题出在哪儿了啊？ 我的连接体系是：载体：2ul； 目的基因：8ul；solutionI：10ul。连接过夜 在转化时20ul体系全部加入到50ulDH5a感受态中，摇菌2h后进行涂板。 在提完重组质粒后进行双酶切的体系是：重组质粒：8ul； EcoRI:0.5ul; XhoI: 0.5ul; 10*H Buffer: 1ul. 酶切1h. 希望各位帮助，感激不尽 |
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