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wzhgaochuan

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[求助] 目的基因连接pGEX-6p-1进行转化的问题

我想要用大肠杆菌来表达目的蛋白，在构建到T载上并测序正确之后，想构建到表达载体pGEX-6p-1上，空载体和目的基因双酶切后电泳回收，条带位置都正确，我的目的基因是900bp。在连接转化DH5a后涂平板，菌斑也长出来了，但挑菌摇菌提质粒后进行双酶切鉴定时发现条带跑的乱七八糟的，无论是载体还是目的基因位置都不对，我做了3次都是这样，也找不出原因，想请教一下高人这是为什么啊？问题出在哪儿了啊？
我的连接体系是：载体：2ul；目的基因：8ul；solutionI：10ul。连接过夜
在转化时20ul体系全部加入到50ulDH5a感受态中，摇菌2h后进行涂板。
在提完重组质粒后进行双酶切的体系是：重组质粒：8ul； EcoRI:0.5ul; XhoI: 0.5ul; 10*H Buffer: 1ul. 酶切1h.
希望各位帮助，感激不尽

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1楼2011-08-15 16:11:52

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liling77ll

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4): Good！ 2011-08-16 23:19:30
wzhgaochuan(金币+1): 谢谢帮忙 2011-08-17 09:10:17

原因可能很多，你可以看看连接酶有没有问题，还有就是你的连接比例，一般连接酶的说明书上都有说明，还有就是你的抗生素是不是失效了，最后还可以看看你的平板是不是放太久了，或许你自己还可以发现其他问题的，慢慢来

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做最好的自己，和自己的昨天对比

6楼2011-08-16 22:09:39

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blackrose8089

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西瓜(金币+1): 鼓励应助 2011-08-16 11:46:12

楼主的重组质粒质粒质量是否确保没问题？

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jiayoubashaonian

2楼2011-08-15 16:14:42

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wzhgaochuan

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wanhscn: 可以用"引用回复",这样可以及时反馈 2011-09-08 10:10:37

应该没问题吧，我提取的其他重组质粒酶切鉴定挺好的，就是这个出不来呢

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3楼2011-08-15 16:25:07

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小七咯

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wzhgaochuan(金币+1): 给了一个没有想到过的提示，谢谢 2011-08-17 09:09:52

有先挑菌然后做PCR检测，确定阳性后再抽质粒验证吗？

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4楼2011-08-16 11:06:43

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西瓜(金币+1): 欢迎交流哈 2011-08-16 23:18:34

是不是目的基因加的太多？

，不是很懂，希望楼主尽早解决问题

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5楼2011-08-16 17:28:54

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引用回帖:

4楼: Originally posted by 小七咯 at 2011-08-16 11:06:43:
有先挑菌然后做PCR检测，确定阳性后再抽质粒验证吗？

这个倒是没有做，可以试试。谢谢提示了！

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7楼2011-08-17 09:06:46

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引用回帖:

6楼: Originally posted by liling77ll at 2011-08-16 22:09:39:
原因可能很多，你可以看看连接酶有没有问题，还有就是你的连接比例，一般连接酶的说明书上都有说明，还有就是你的抗生素是不是失效了，最后还可以看看你的平板是不是放太久了，或许你自己还可以发现其他问题的，慢 ...

这些原因应该都不存在，因为我们同时在做别的蛋白，用的都是一样的东西，都没有问题的~~~

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8楼2011-08-17 09:08:16

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