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friya0910

新虫 (正式写手)

[求助] 表达载体构建的相关问题

现在要构建表达载体,有一些问题不是很明确,希望懂得的不吝赐教啊!
首先是双酶切表达载体和带有目的片段的T载体,一般都切多少时间啊?我看有说切过夜的,也有切几个小时的!切完以后大家都从哪些方面确定酶切完全不完全呢?
其次是连接以后除了直接转化以外,还有什么方法确定是否连接上了呢?
本人新手一个,对于这方面不是很了解,希望各位帮帮忙!
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 千king寻 at 2011-07-20 14:04:28
双酶切37度水浴2——3个小时,之后琼脂糖凝胶电泳观察条带,若条带正确则切胶回收,此时回收的为带有两个酶切位点的目的片段。该目的片段与已经带有该酶切位点的载体进行连接,若用T4连接酶,则需16度金属浴过夜连接 ...

"此时回收的为带有两个酶切位点的目的片段。该目的片段与已经带有该酶切位点的载体进行连接,"

1,载体双酶切后需要纯化回收吗?
2,转化液涂板是否需要加入IPTG诱导(PET载体,非T载体)?
我每次按上述过程操作后能够得到不少斑,但是大部分都是假阳性,不知什么原因
15楼2013-10-24 22:56:38
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

【答案】应助回帖

★ ★
friya0910(金币+2): 2011-07-18 15:25:29
西瓜(金币+2): 鼓励应助 2011-07-18 16:32:08
friya0910(金币+1): 2011-07-19 17:10:50
如果你的片段大的话就过夜切吧,我一般都是过夜切,用fermentas的酶。如果不过夜切的话,中间隔4-5个小时就差不多吧。确定连接与否,你可以做一下菌落pcr,p一下你的目的条带。好好做,加油!
生命即这般无尽变数,辗转来去皆苛求不得
2楼2011-07-18 15:18:40
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friya0910

新虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by 青菜小虫 at 2011-07-18 15:18:40:
如果你的片段大的话就过夜切吧,我一般都是过夜切,用fermentas的酶。如果不过夜切的话,中间隔4-5个小时就差不多吧。确定连接与否,你可以做一下菌落pcr,p一下你的目的条带。好好做,加油!

菌落PCR的话就还是要把连接液做转化喽,看来没有什么捷径啊!我的片段不大,才300bp,“中间隔4-5个小时”是什么意思啊?
3楼2011-07-18 15:27:39
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

【答案】应助回帖


西瓜(金币+1): 鼓励交流 2011-07-18 16:32:39
friya0910(金币+1): 2011-07-19 17:10:57
引用回帖:
Originally posted by friya0910 at 2011-07-18 15:27:39:
菌落PCR的话就还是要把连接液做转化喽,看来没有什么捷径啊!我的片段不大,才300bp,“中间隔4-5个小时”是什么意思啊?

就是酶切时间4或5个小时啦,你的片段这么小哇。那你怎么做连接啊?
生命即这般无尽变数,辗转来去皆苛求不得
4楼2011-07-18 15:36:51
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