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happywoheni

铁虫 (小有名气)

[求助] 关于pet28克隆载体

pcr产物和pet28质粒经双酶切之后可以直接连接转化到大肠DH5a吗?pet28好像是低拷贝的,怎样提高拷贝数?EcoR1和BamH1同时切还是分步切?用哪种酶切缓冲液?酶切完了是不是都要进行电泳回收片段?
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3, EPI+1): 热心!关于是否需要回收的解释很到位。 2011-07-22 12:02:27
引用回帖:
Originally posted by happywoheni at 2011-07-14 16:20:36:
pcr产物和pet28质粒经双酶切之后可以直接连接转化到大肠DH5a吗?pet28好像是低拷贝的,怎样提高拷贝数?EcoR1和BamH1同时切还是分步切?用哪种酶切缓冲液?酶切完了是不是都要进行电泳回收片段?

质粒的拷贝数跟感受态受体菌有关系,跟质粒自身的特性也有关系。你可以把筛选的阳性克隆过夜摇菌后再加阿拉伯糖摇4-5小时提质粒,这样可以提高拷贝数。两种酶可以同时切,缓冲液你到他们网站上就能查到,不过刚开始做实验建议你分步切。是不是要进行回收要看你酶切的目的,如果只是为了鉴定就不用回收,如果片段还要用于后续实验那就需要回收
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
5楼2011-07-22 11:03:59
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查看全部 6 个回答

天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖


happywoheni(金币+1): 2011-07-15 08:06:32
西瓜(金币+1): 鼓励 2011-07-22 12:00:54
在DH5α里面是高拷贝的吧?难道我记错了?
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2011-07-14 21:44:15
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cloverplm

金虫 (小有名气)

★ ★
西瓜(金币+2): 欢迎新虫交流 2011-07-22 12:01:04
可以换BL21核TOP10菌株试试。
净——静——竞——进
3楼2011-07-21 21:41:31
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zj20101989

木虫 (小有名气)

孤雪飞萍

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): Good! 2011-07-22 12:01:30
可以直接转进5a中,拷贝数应当没问题,验证后可直接送样测序。
EcoR1和BamH1同时切,用H Buffer.
都要电泳回收,也可用乙醇沉淀回收。
随缘随性,不争不胜。
4楼2011-07-21 21:49:55
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