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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于pet28克隆载体
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happywoheni

铁虫 (小有名气)

[求助] 关于pet28克隆载体

pcr产物和pet28质粒经双酶切之后可以直接连接转化到大肠DH5a吗？pet28好像是低拷贝的，怎样提高拷贝数？EcoR1和BamH1同时切还是分步切？用哪种酶切缓冲液？酶切完了是不是都要进行电泳回收片段？
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1楼 2011-07-14 16:20:36
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★
happywoheni(金币+1): 2011-07-15 08:06:32
西瓜(金币+1): 鼓励 2011-07-22 12:00:54
在DH5α里面是高拷贝的吧？难道我记错了？
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2011-07-14 21:44:15
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cloverplm

金虫 (小有名气)
★ ★
西瓜(金币+2): 欢迎新虫交流 2011-07-22 12:01:04
可以换BL21核TOP10菌株试试。
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净——静——竞——进
3楼2011-07-21 21:41:31
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zj20101989

木虫 (小有名气)

孤雪飞萍

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): Good！ 2011-07-22 12:01:30
可以直接转进5a中，拷贝数应当没问题，验证后可直接送样测序。
EcoR1和BamH1同时切，用H Buffer.
都要电泳回收，也可用乙醇沉淀回收。
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随缘随性，不争不胜。
4楼2011-07-21 21:49:55
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3, EPI+1): 热心！关于是否需要回收的解释很到位。 2011-07-22 12:02:27
引用回帖:
Originally posted by happywoheni at 2011-07-14 16:20:36:
pcr产物和pet28质粒经双酶切之后可以直接连接转化到大肠DH5a吗？pet28好像是低拷贝的，怎样提高拷贝数？EcoR1和BamH1同时切还是分步切？用哪种酶切缓冲液？酶切完了是不是都要进行电泳回收片段？

质粒的拷贝数跟感受态受体菌有关系，跟质粒自身的特性也有关系。你可以把筛选的阳性克隆过夜摇菌后再加阿拉伯糖摇4-5小时提质粒，这样可以提高拷贝数。两种酶可以同时切，缓冲液你到他们网站上就能查到，不过刚开始做实验建议你分步切。是不是要进行回收要看你酶切的目的，如果只是为了鉴定就不用回收，如果片段还要用于后续实验那就需要回收
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
5楼2011-07-22 11:03:59
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lixing4111

新虫 (初入文坛)
关于酶切要注意的是不同的公司用的buffer也不一样……

比如 takara家的酶就不一样，EcoRI 要用H buffer 而BamHI需要K Buffer，在双酶切的时候用的是K Buffer。

注意看一下每家公司的产品说明书……上面都会有写。

祝你好运
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6楼2013-05-30 14:46:16
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