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金虫 (小有名气)

[求助] western和PCR选择问题

做细胞凋亡的实验,想测定caspase-3,9蛋白,想问下是用半定量PCR还是western对其进行测定比较好?是不是都是说明凋亡问题,哪个更好一点,还是其中一个用PCR另一个用western?请详细说明一下二者的区别,测定后分别能说明的问题!新手请教高手帮忙!!
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金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by terry130 at 2011-06-30 12:09:35:
mitochondrial apoptotic pathway的话你可以检测cytochrome c release,也是用western,这个数据比较坚挺的~

恩,这个我是要做的,western我只想做个cytC的释放,就是不知道caspase-3,9需不需要做western,还是选个别的方法只是测一下活性.
7楼2011-06-30 13:35:28
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查看全部 8 个回答

cdl007

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): 2011-06-30 07:42:45
瘪(金币+2): 2011-06-30 19:18:32
Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞浆中,在凋亡的早期阶段,它被激活,活化的Caspase-3由两个大亚基(17KD)和两个小亚基(12KD)组成,裂解相应的胞浆胞核底物,最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞,caspase-3的活性明显下降。

一般检测凋亡要有pro-caspase3(32KD)减少的趋势,活化caspase3(17KD)增加的趋势。这是指western
PCR 需要做一下的,但是结果不一定和western的一致。因为caspase的变化主要是蛋白的活化。

caspase9 买相应抗体即可
2楼2011-06-30 06:57:30
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terry130

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

瘪(金币+3): 2011-06-30 19:18:27
检测凋亡的话用PCR没用,mRNA水平的变化不能直接联系到凋亡水平上。你需要做更直接的检测,比如LS说的caspase3 cleavage实验。
除此之外,还有很多其他手段检测细胞凋亡。
比如roche的 Cell death Elisa 试剂盒
酶学检测来测定caspase 3 activity(这个也有专门的试剂盒)
或者更直接点用凋亡敏感的染料直接染细胞 如PI、ANNEXIN V等,直接镜检或者上流式细胞仪都可以。
现在的文章中比较主流的数据都是一些试剂盒或者是流式的数据。这些比较可信。
摒气动方息,宁神心自明。
3楼2011-06-30 07:45:01
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金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by cdl007 at 2011-06-30 06:57:30:
Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞浆中,在凋亡的早期阶段,它被激活,活化的Caspase-3由两个大亚基(17KD)和两个小亚基(12KD)组成,裂解相应的胞浆胞核底物,最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和 ...

谢谢,我现在是实验设计阶段,主要是想丰富下实验方法,想从线粒体途径检测细胞凋亡,因为还有一年毕业,所以试验量是已经够多了,像三楼说的双染我也做,我想问下,我用caspase-3,9活性试剂盒测下他的活性,和用western测定这两个蛋白有差么?是不是western更有说服力,还是说明的结果和问题都是一样的就没所谓采用哪种方法呢?
4楼2011-06-30 10:05:28
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