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瘪

金虫 (小有名气)

[求助] western和PCR选择问题

做细胞凋亡的实验，想测定caspase-3,9蛋白，想问下是用半定量PCR还是western对其进行测定比较好？是不是都是说明凋亡问题，哪个更好一点，还是其中一个用PCR另一个用western？请详细说明一下二者的区别，测定后分别能说明的问题！新手请教高手帮忙！！
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1楼 2011-06-29 16:03:44
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terry130

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

瘪(金币+3): 2011-06-30 19:18:27
检测凋亡的话用PCR没用，mRNA水平的变化不能直接联系到凋亡水平上。你需要做更直接的检测，比如LS说的caspase3 cleavage实验。
除此之外，还有很多其他手段检测细胞凋亡。
比如roche的 Cell death Elisa 试剂盒
酶学检测来测定caspase 3 activity（这个也有专门的试剂盒）
或者更直接点用凋亡敏感的染料直接染细胞 如PI、ANNEXIN V等，直接镜检或者上流式细胞仪都可以。
现在的文章中比较主流的数据都是一些试剂盒或者是流式的数据。这些比较可信。
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摒气动方息，宁神心自明。
3楼2011-06-30 07:45:01
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cdl007

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): 2011-06-30 07:42:45
瘪(金币+2): 2011-06-30 19:18:32
Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。

一般检测凋亡要有pro-caspase3（32KD）减少的趋势，活化caspase3（17KD）增加的趋势。这是指western
PCR 需要做一下的，但是结果不一定和western的一致。因为caspase的变化主要是蛋白的活化。

caspase9 买相应抗体即可
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2楼2011-06-30 06:57:30
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瘪

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by cdl007 at 2011-06-30 06:57:30:
Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和 ...

谢谢，我现在是实验设计阶段，主要是想丰富下实验方法，想从线粒体途径检测细胞凋亡，因为还有一年毕业，所以试验量是已经够多了，像三楼说的双染我也做，我想问下，我用caspase-3，9活性试剂盒测下他的活性，和用western测定这两个蛋白有差么？是不是western更有说服力，还是说明的结果和问题都是一样的就没所谓采用哪种方法呢?
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4楼2011-06-30 10:05:28
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瘪

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by terry130 at 2011-06-30 07:45:01:
检测凋亡的话用PCR没用，mRNA水平的变化不能直接联系到凋亡水平上。你需要做更直接的检测，比如LS说的caspase3 cleavage实验。
除此之外，还有很多其他手段检测细胞凋亡。
比如roche的 Cell death Elisa 试剂盒 ...

谢谢，我现在在设计我的试验方法，就是想让方法更丰富一些，想从线粒体凋亡途径说明凋亡，所以会检测caspase家族蛋白，你说的双染这个我也做，还有TUNEL，这两个我会选其中一个做。我看好多文章都做了caspase或者bcl-2以及其他一些相关蛋白的mRNA检测，所以我也想增加PCR这个方法，可以代替caspase的western检测。因为我还有其他蛋白做western，不想都是western这一个方法。
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5楼2011-06-30 10:12:15
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