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lmzxcom1

金虫 (著名写手)

[求助] 基因中存在发卡结构

本人在pET30a质粒上插入了一个基因片段,整个转录出来的mRNA应该是组氨酸标签--S-tag--基因序列,在基因的5'端出现了一个发卡结构ATGCCTXXXXXXXXXXXXXXXAGG,据说在N端存在发卡结构可能导致翻译困难,但是组氨酸标签一段在这个发卡结构之前,这个时候还能形成发卡结构么,会对基因表达造成影响?我本人诱导表达之后,有明显的酶活,但是蛋白点用完成看不出来。。。

[ Last edited by lmzxcom1 on 2011-6-24 at 10:15 ]
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

★ ★
西瓜(金币+2): 很热心的专家! 2011-06-24 10:58:37
引用回帖:
Originally posted by lmzxcom1 at 2011-06-24 10:31:17:
首先感谢你的回答。
我调整过诱导条件,IPTG的诱导浓度在50μM到70μM,温度控制在20度,诱导时间从4小时到8小时,蛋白电泳中,诱导表达的破胞上清与碎片相比空白都没有明显条带出现,这个不清楚什么情况,会 ...

温度低,诱导时间就要相应延长的。稀有密码子也影响表达的,你可以用软件或者在线分析下。
4楼2011-06-24 10:55:31
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
lmzxcom1(金币+1): 谢谢 2011-06-24 10:36:11
西瓜(金币+5, EPI+1): 专家就是专家 2011-06-24 10:43:22
先诱导和未诱导、宿主菌酶活对照下,有明显酶活表达就没问题。其实前面5‘端还有His-tag的话,你这个发夹结构也不在5’-端了,另外你这个发夹结构才三对碱基配对,不明显的,应该影响不大。活性低的话,可以考虑再去优化表达条件。
2楼2011-06-24 10:19:28
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lmzxcom1

金虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2011-06-24 10:19:28:
先诱导和未诱导、宿主菌酶活对照下,有明显酶活表达就没问题。其实前面5‘端还有His-tag的话,你这个发夹结构也不在5’-端了,另外你这个发夹结构才三对碱基配对,不明显的,应该影响不大。活性低的话,可以考虑再 ...

首先感谢你的回答。
我调整过诱导条件,IPTG的诱导浓度在50μM到70μM,温度控制在20度,诱导时间从4小时到8小时,蛋白电泳中,诱导表达的破胞上清与碎片相比空白都没有明显条带出现,这个不清楚什么情况,会不会有稀有密码子的问题
3楼2011-06-24 10:31:17
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lmzxcom1

金虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2011-06-24 10:55:31:
温度低,诱导时间就要相应延长的。稀有密码子也影响表达的,你可以用软件或者在线分析下。

有关hairpin的问题,我从新看了一下,在序列的中间,还存在一段,比较明显的ATGCCCAGCAGCTGGGCGGTGCCCA,里面存在两个hairpin,一个hairpin存在6个连续的序列,另一个hairpin有5个连续的序列。
稀有密码子也查过了,有5.6%的含量,并且有两个稀有密码子连续的情况。
不过我根据有酶活,没有明显蛋白表达这个表象,决定用37度,1mMIPTG诱导,看看到底有没有表达蛋白
5楼2011-06-24 12:22:59
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