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lmzxcom1

金虫 (著名写手)

[求助] 基因中存在发卡结构

本人在pET30a质粒上插入了一个基因片段，整个转录出来的mRNA应该是组氨酸标签--S-tag--基因序列，在基因的5'端出现了一个发卡结构ATGCCTXXXXXXXXXXXXXXXAGG,据说在N端存在发卡结构可能导致翻译困难，但是组氨酸标签一段在这个发卡结构之前，这个时候还能形成发卡结构么，会对基因表达造成影响？我本人诱导表达之后，有明显的酶活，但是蛋白点用完成看不出来。。。

[ Last edited by lmzxcom1 on 2011-6-24 at 10:15 ]
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1楼 2011-06-24 10:13:36
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lmzxcom1

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2011-06-24 10:19:28:
先诱导和未诱导、宿主菌酶活对照下，有明显酶活表达就没问题。其实前面5‘端还有His-tag的话，你这个发夹结构也不在5’-端了，另外你这个发夹结构才三对碱基配对，不明显的，应该影响不大。活性低的话，可以考虑再 ...

首先感谢你的回答。
我调整过诱导条件，IPTG的诱导浓度在50μM到70μM，温度控制在20度，诱导时间从4小时到8小时，蛋白电泳中，诱导表达的破胞上清与碎片相比空白都没有明显条带出现，这个不清楚什么情况，会不会有稀有密码子的问题
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3楼2011-06-24 10:31:17
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
lmzxcom1(金币+1): 谢谢 2011-06-24 10:36:11
西瓜(金币+5, EPI+1): 专家就是专家 2011-06-24 10:43:22
先诱导和未诱导、宿主菌酶活对照下，有明显酶活表达就没问题。其实前面5‘端还有His-tag的话，你这个发夹结构也不在5’-端了，另外你这个发夹结构才三对碱基配对，不明显的，应该影响不大。活性低的话，可以考虑再去优化表达条件。
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2楼2011-06-24 10:19:28
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
西瓜(金币+2): 很热心的专家！ 2011-06-24 10:58:37
引用回帖:
Originally posted by lmzxcom1 at 2011-06-24 10:31:17:
首先感谢你的回答。
我调整过诱导条件，IPTG的诱导浓度在50μM到70μM，温度控制在20度，诱导时间从4小时到8小时，蛋白电泳中，诱导表达的破胞上清与碎片相比空白都没有明显条带出现，这个不清楚什么情况，会 ...

温度低，诱导时间就要相应延长的。稀有密码子也影响表达的，你可以用软件或者在线分析下。
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4楼2011-06-24 10:55:31
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lmzxcom1

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2011-06-24 10:55:31:
温度低，诱导时间就要相应延长的。稀有密码子也影响表达的，你可以用软件或者在线分析下。

有关hairpin的问题，我从新看了一下，在序列的中间，还存在一段，比较明显的ATGCCCAGCAGCTGGGCGGTGCCCA,里面存在两个hairpin，一个hairpin存在6个连续的序列，另一个hairpin有5个连续的序列。
稀有密码子也查过了，有5.6%的含量，并且有两个稀有密码子连续的情况。
不过我根据有酶活，没有明显蛋白表达这个表象，决定用37度，1mMIPTG诱导，看看到底有没有表达蛋白
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5楼2011-06-24 12:22:59
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