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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 拟南芥原生质分离实验～～
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shaquila

金虫 (正式写手)

[求助] 拟南芥原生质分离实验～～

配好酶溶液后叶片放进去抽真空40分钟，室温放置5小时，叶片还是没有溶解，原生质基本没啥释放，叶片大小为2-3mm（因为叶龄较老，不好切）

配方：
酶溶液 (10ml):
甘露醇0.4 M, KCl        20mM, MES(0.5M,pH5.7) 20mM, 纤维素酶R10 150mg, 离析酶R10 40mg       
在  55℃加入酶溶液10分钟 (失活蛋白酶并增强酶的溶解性)用之前冷却至室温

1M CaCl2        0.1ml        10mM
β-巯基乙醇        4μL        5mM
10% FBS (用BSA代替了)        0.1ml        0.1%
过0.45 μm滤器（用0.22代替）
酶溶液要是亮棕色并且澄清
我的酶液是基本无色，纤维素酶R10这个东东是黄色粉末，但是溶解后颜色没有那么深，买的是Cellulase from Aspergillus niger（sigma），离析酶R10是Pectinase from Aspergillus niger（sigma），不知道是不是这两个出问题？
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shaquila

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1楼 2011-06-22 19:51:01
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shaquila

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by syn1985 at 2011-06-24 14:50:34:
我当时用的酶是我们老师买的 就是从国内一家生物公司买的 应该是sigma的 酶的名字就和那篇文献里面写的一样的

我发现里面推荐的酶是yakult的日本公司，但是在国内好像很难买到～～
sigma的酶好像不大好用，能帮我确认下吗？
如果是yakult的，要和哪个公司联系，谢谢啦
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10楼2011-06-28 11:17:26
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
难得在本版见到玩字体的，帮顶下
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2楼2011-06-22 21:48:41
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wuzuobin125

铜虫 (小有名气)
没有做过这方面的实验，等待楼下高手出招。
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3楼2011-06-23 00:44:28
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gwbk

木虫 (正式写手)
感兴趣~对这方面没经验。期望大牛来指导一下~
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4楼2011-06-23 00:59:14
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tiaotiger

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励交流！崩溃酶这名字很牛逼的样子……孤陋寡闻了，待我google看看，呵呵～ 2011-06-24 10:08:18
shaquila(金币+10): 我看别人硕士论文有用4种酶比较，好像还有一中半纤维酶，比较下可以互相配合，谢谢呀～～但是论文里面没有关于产品的描述，这点不利于后面的人重复～～ 2011-06-24 14:38:20
可以试用下崩溃酶，我用来制备丝状真菌原生质体，效果很好！
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5楼2011-06-24 10:02:53
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syn1985

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): Good！ 2011-06-24 10:44:34
shaquila(金币+10): 谢谢 2011-06-24 14:36:09
引用回帖:
Originally posted by shaquila at 2011-06-22 19:51:01:
配好酶溶液后叶片放进去抽真空40分钟，室温放置5小时，叶片还是没有溶解，原生质基本没啥释放，叶片大小为2-3mm（因为叶龄较老，不好切）

配方：
酶溶液 (10ml):
甘露醇0.4 M, KCl        20mM, MES(0. ...

这个实验我1年前做过，首先40d龄的叶片细胞状态最好，如果太老了就算你分离出来了原生质体你也会发现叶绿素分布已经开始不均匀了，这对后面的质粒转化是非常不利的。
我没记错的话nature上有一篇文章详细讲解了如何做这个，好好看看文献吧
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6楼2011-06-24 10:41:35
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shaquila

金虫 (正式写手)
谢谢楼上～～～～～
应该是我买的酶有问题
分别是Pectinase from Aspergillus niger
和Cellulase from Aspergillus niger，但是别人买的是Cellulase from Trichoderma viride和Pectinase from Rhizopus sp.
其中cellulase活性竟然是我的10倍，悲催
pectinase from AN的酶活定义竟然是50度，神马东西嘛。。。
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7楼2011-06-24 14:35:41
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shaquila

金虫 (正式写手)
另外，谁知道国内哪里有卖这两种酶的，到货时间较快的？
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8楼2011-06-24 14:45:05
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syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by shaquila at 2011-06-24 14:45:05:
另外，谁知道国内哪里有卖这两种酶的，到货时间较快的？

我当时用的酶是我们老师买的 就是从国内一家生物公司买的 应该是sigma的 酶的名字就和那篇文献里面写的一样的
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9楼2011-06-24 14:50:34
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