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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 拟南芥原生质分离实验～～
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十比

木虫 (著名写手)
最好用yakult的日本公司 的酶，北京普博欣公司就有，我们一直在用，挺好的，你
的真空太久了吧，我们有时都不抽的，有也是1分钟就OK，酶解时慢摇可能会好点。
建议看看这个实验室http://genetics.mgh.harvard.edu/sheenweb/main_page.html　几乎全世界做原生质体的方法都来自这里。
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11楼2011-06-28 12:53:44
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十比

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): Good 2011-06-28 22:55:25
另我，去年好象有篇plant method上的文章用“三明治”的方法也可以，对于较老的叶子可能更可能，因为其是把下表皮用胶带去掉再酶解的。 我们一般用20天左右的叶子酶解2h左右还挺多的。
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12楼2011-06-28 12:58:35
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shaquila

金虫 (正式写手)
送鲜花一朵
谢谢楼上～～～～～
很详细～～～
sheen的方法包括在nature protocol的都查过了，确实只用yakult的酶，所以我也准备去买，谢谢拉
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13楼2011-06-28 16:26:03
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shaquila

金虫 (正式写手)
因为原生质体有叶绿体，在明场下绿色很多，一般是不是用DIC来看？
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14楼2011-06-28 16:27:16
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syn1985

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-06-28 22:55:54
酶解液：
甘露醇        1.09g
纤维素酶R10        0.15g
离析酶R10        0.045g
0.3M KCl        1ml
0.1M MES        3ml
混合后55℃        水浴10min后冷却至室温
0.15M CaCl        1ml
β-巯基乙醇        50ul
1.5%BSA        1ml
加无菌水至        15ml
这是我做的时候用的酶解液配方 具体用的牌子急得不得了 好像当时用的就是sigma的，因为我已经从那个实验室毕业一年了，所以没法帮你问了，你再试试吧，如果你的研究对象是哥伦比亚号拟南芥应该没有问题的
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15楼2011-06-28 19:39:51
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shaquila

金虫 (正式写手)
恩，谢谢楼上，药品要到了，我在试试~~~~
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16楼2011-06-28 20:48:43
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十比

木虫 (著名写手)
★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-06-30 03:01:20
关键你用原生质体来作什么用？ DIC只是看起来有点立体的效果而已，如看荧光的话，叶绿体有自发荧光，所以最好不要用RFP瞬转绿叶片原生质体。
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17楼2011-06-29 22:28:38
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shaquila

金虫 (正式写手)
我的那个蛋白可能定位于叶绿体，所以我要利用自发光和GFP fusion来判断其定位～～～
所以我想在添加一个明场画面，但是明场叶绿体是绿色的，我貌似没见过有人用这种画面，大部分用DIC显示未激发和merge后的，比较清晰
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18楼2011-06-30 11:10:35
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十比

木虫 (著名写手)
这个没关系的，荧光状态下拍的照片都是黑白的，想要什么颜色都是可以自己加的，而且在明场下的绿色和GFP的绿有很大的差别的，我觉得可以不用DIC。
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19楼2011-07-03 10:07:47
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shaquila

金虫 (正式写手)
啊，我们用配的ccd拍出来是绿色的，但是我估计也不用DIC了，我merge时候就在荧光下merge，嘿嘿～～
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20楼2011-07-04 17:37:57
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