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十比

木虫 (著名写手)

最好用yakult的日本公司 的酶,北京普博欣公司就有,我们一直在用,挺好的,你
的真空太久了吧,我们有时都不抽的,有也是1分钟就OK,酶解时慢摇可能会好点。
建议看看这个实验室http://genetics.mgh.harvard.edu/sheenweb/main_page.html 几乎全世界做原生质体的方法都来自这里。
11楼2011-06-28 12:53:44
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十比

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): Good 2011-06-28 22:55:25
另我,去年好象有篇plant method上的文章用“三明治”的方法也可以,对于较老的叶子可能更可能,因为其是把下表皮用胶带去掉再酶解的。 我们一般用20天左右的叶子酶解2h左右还挺多的。
12楼2011-06-28 12:58:35
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shaquila

金虫 (正式写手)

送鲜花一朵
谢谢楼上~~~~~
很详细~~~
sheen的方法包括在nature protocol的都查过了,确实只用yakult的酶,所以我也准备去买,谢谢拉
13楼2011-06-28 16:26:03
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shaquila

金虫 (正式写手)

因为原生质体有叶绿体,在明场下绿色很多,一般是不是用DIC来看?
14楼2011-06-28 16:27:16
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syn1985

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-06-28 22:55:54
酶解液:
甘露醇        1.09g
纤维素酶R10        0.15g
离析酶R10        0.045g
0.3M KCl        1ml
0.1M MES        3ml
混合后55℃        水浴10min后冷却至室温
0.15M CaCl        1ml
β-巯基乙醇        50ul
1.5%BSA        1ml
加无菌水至        15ml
这是我做的时候用的酶解液配方 具体用的牌子急得不得了 好像当时用的就是sigma的,因为我已经从那个实验室毕业一年了,所以没法帮你问了,你再试试吧,如果你的研究对象是哥伦比亚号拟南芥应该没有问题的
15楼2011-06-28 19:39:51
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shaquila

金虫 (正式写手)

恩,谢谢楼上,药品要到了,我在试试~~~~
16楼2011-06-28 20:48:43
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十比

木虫 (著名写手)

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-06-30 03:01:20
关键你用原生质体来作什么用? DIC只是看起来有点立体的效果而已,如看荧光的话,叶绿体有自发荧光,所以最好不要用RFP瞬转绿叶片原生质体。
17楼2011-06-29 22:28:38
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shaquila

金虫 (正式写手)

我的那个蛋白可能定位于叶绿体,所以我要利用自发光和GFP fusion来判断其定位~~~
所以我想在添加一个明场画面,但是明场叶绿体是绿色的,我貌似没见过有人用这种画面,大部分用DIC显示未激发和merge后的,比较清晰
18楼2011-06-30 11:10:35
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十比

木虫 (著名写手)

这个没关系的,荧光状态下拍的照片都是黑白的,想要什么颜色都是可以自己加的,而且在明场下的绿色和GFP的绿有很大的差别的,我觉得可以不用DIC。
19楼2011-07-03 10:07:47
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shaquila

金虫 (正式写手)

啊,我们用配的ccd拍出来是绿色的,但是我估计也不用DIC了,我merge时候就在荧光下merge,嘿嘿~~
20楼2011-07-04 17:37:57
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