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shaquila

金虫 (正式写手)

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[求助] 拟南芥原生质分离实验～～

配好酶溶液后叶片放进去抽真空40分钟，室温放置5小时，叶片还是没有溶解，原生质基本没啥释放，叶片大小为2-3mm（因为叶龄较老，不好切）

配方：
酶溶液 (10ml):
甘露醇0.4 M, KCl 20mM, MES(0.5M,pH5.7) 20mM, 纤维素酶R10 150mg, 离析酶R10 40mg
在 55℃加入酶溶液10分钟 (失活蛋白酶并增强酶的溶解性)用之前冷却至室温

1M CaCl2 0.1ml 10mM
β-巯基乙醇 4μL 5mM
10% FBS (用BSA代替了) 0.1ml 0.1%
过0.45 μm滤器（用0.22代替）
酶溶液要是亮棕色并且澄清
我的酶液是基本无色，纤维素酶R10这个东东是黄色粉末，但是溶解后颜色没有那么深，买的是Cellulase from Aspergillus niger（sigma），离析酶R10是Pectinase from Aspergillus niger（sigma），不知道是不是这两个出问题？

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shaquila

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1楼 2011-06-22 19:51:01

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syn1985

木虫 (正式写手)

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专业: 病原细菌与放线菌生物学

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-06-28 22:55:54

酶解液：
甘露醇 1.09g
纤维素酶R10 0.15g
离析酶R10 0.045g
0.3M KCl 1ml
0.1M MES 3ml
混合后55℃ 水浴10min后冷却至室温
0.15M CaCl 1ml
β-巯基乙醇 50ul
1.5%BSA 1ml
加无菌水至 15ml
这是我做的时候用的酶解液配方具体用的牌子急得不得了好像当时用的就是sigma的，因为我已经从那个实验室毕业一年了，所以没法帮你问了，你再试试吧，如果你的研究对象是哥伦比亚号拟南芥应该没有问题的