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20100136

铜虫 (初入文坛)


[交流] 蛋白切胶回收 做质谱

本人有一PEG修饰蛋白,修饰后分子量在90kD左右,想通过MALDI-TOF测定分子量。问题是蛋白纯度不高,想通过PAGE胶回收的方法获得高纯度的蛋白。搜索了论坛有关蛋白胶回收的帖子,收益匪浅,但仍有问题请教大家:

1. 关于电泳 变性还是非变性:我的用途是测定分子量,跑电泳可以是SDS-PAGE吗?SDS会污染样品导致分子量测定结果吗?最保险的方法是native-PAGE?

2.关于电泳后的蛋白洗脱:论坛上给出了两种方法,一是将胶切碎或研碎,置于溶液中,冰箱过夜,离心得上清再透析浓缩;二是电洗脱,置于透析袋中水平电泳。第一种方法比较简单,但是我担心研碎的过程会不会导致胶成分小部分溶解,从而导致上清中成分复杂,影响质谱测定?在这点上说是不是电洗脱方法会好一点呢?

请虫友们帮忙分析分析,先行谢过啦!
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20100136

铜虫 (初入文坛)


大家帮帮忙啊!谢谢哦!
2楼2011-06-23 10:08:59
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renruntan

禁虫 (著名写手)


20100136(金币+1):谢谢参与
本帖内容被屏蔽

3楼2011-06-23 11:23:25
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20100136

铜虫 (初入文坛)


引用回帖:
Originally posted by renruntan at 2011-06-23 11:23:25:
同求啊!

楼上的虫友也做这方面工作吗?
4楼2011-06-23 12:20:04
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renruntan

禁虫 (著名写手)

本帖内容被屏蔽

5楼2011-06-23 12:31:54
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susanbao

铁虫 (初入文坛)



20100136(金币+1):谢谢参与
其实蛋白做MALDI-TOF,SDS-PAGE电泳可以的,不必纯化,直接给胶就可以了,保证3ug量就够了
6楼2011-06-23 14:49:01
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20100136

铜虫 (初入文坛)


引用回帖:
Originally posted by susanbao at 2011-06-23 14:49:01:
其实蛋白做MALDI-TOF,SDS-PAGE电泳可以的,不必纯化,直接给胶就可以了,保证3ug量就够了

请问楼上的虫友,你的MALDI-TOF是在哪里做的?90kd的蛋白是不是不容易做啊?
7楼2011-06-23 16:29:59
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yaiqi-87

铜虫 (小有名气)



20100136(金币+1): 谢谢参与
你好,本人最近在用20KD PEG修饰24KD左右的蛋白,但在跑15% SDS-PAGE电泳后,染色发现经修饰的蛋白拖尾现象很严重,请问你遇到过这种现象吗?该如何解决呢?谢谢!
8楼2013-08-10 09:56:51
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jinyanyan

铜虫 (小有名气)



20100136(金币+1): 谢谢参与
SDS-page的分子量可能和理论分子量有些差异,我的蛋白的size就偏大,打质谱的时候直接从胶上切下目的条带送去就行
9楼2013-08-18 10:08:04
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