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荧光定量Q-PCR 标准曲线优化问题
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做了两锅梯度稀释的标准曲线 早上的那锅发现后面三个低浓度梯度的基本不出峰，或者峰很低 于是下午就从10倍稀释变为5倍稀释 但是结果显示曲线的拟合度不好R值从早上的0.94讲到0.76了，扩增效率增加了20%； 同时重复性像是也没有早上的好， 想问问，一条标准曲线7个标准品的稀释梯度够吗？ 加完样，是否要对8联管进行轻微离心？ 天根的试剂盒上没写溶解曲线步骤的温度程序，设为 Melt Curve 65.0 to 95.0 C, increment 0.5 C, 0:05 + Plate Read 是否最佳？ 下一步也不知道怎么调整了 谢谢大牛了  |
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4楼2011-06-13 21:59:53
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【答案】应助回帖
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silicare(金币+3, EPI+1): 2011-06-10 12:20:50
churmi(金币+5): 2011-06-13 21:58:25
silicare(金币+3, EPI+1): 2011-06-10 12:20:50
churmi(金币+5): 2011-06-13 21:58:25
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1. 5个点足够了，但是不能少于5个。R值不能低于0.998 ，否则文章不收。其实这个R值很好做到的。我都是加96孔板，同是做几条标曲，用来测扩增效率。只要每步注意分装混匀就没问题，自己先规划好。 2.加完样最好离心，因为8连管在你盖帽子的时候往往会溅起液滴。 3.溶解曲线程序不是试剂盒决定的，是机器决定的。你机器能支持多高的精度，你实验需要多高的精度。比如：你如果想知道最后产物的TM精确到0.1°，那你就调0.1°采一次数据，只要你机器能做到。 4.你的实验，我建议先在纸上把加样过程写好，每步加什么，怎么加，加多少。另外，少量的比如：引物模板一定不要一次次加，要大量加然后分装，否则R值很难达到。每个设3个平行。最后，提醒下，要先排除你稀释产物的操作没问题，也就是梯度模板没问题。 |
2楼2011-06-09 13:31:16
3楼2011-06-10 10:46:10
