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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 载体酶切
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meizishu

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【分子生物】EPI帖

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1楼 2011-05-20 20:52:46
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yabxxh

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
1949stone(EPI+1): 来也 2011-05-21 12:39:37
呵呵，这个问题我以前遇见过。
既然你的对照质粒能跑出来，那说明质粒没问题。
为什么单酶切和双酶切都没有了呢，我们通常叫切碎了，因为你说的很简单，并没有给出酶切体系中各个成分的数据，以及酶切时间，哪个公司的何种内切酶，笼统分析如下：
1.你用的酶有星号活性，而你采用的是10ul体系，枪头随便沾上一点内切酶就会过量，尤其你做双酶切的时候，酶过量的结果就是甘油的浓度过大，然后内切酶产生星号活性，切碎了你的质粒。
2.你的酶切时间过长，切碎这种情况通常发生在过夜酶切的时候，中间的原因我就不说了，如果只是鉴定的话，建议快速内切酶酶切30min，普通内切酶3h。
3.你用的是快速内切酶，酶切时间过长。切碎的情况常见于快速内切酶，普通的也有，但是我和不幸的没有遇到过。
4.你没有好好研究内切酶说明书，忽略了说明书上的注意事项。
5.最不可能的情况，你选错了温度。
以上，好运
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2楼2011-05-21 09:28:09
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272401213

木虫 (正式写手)
顶楼上！
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YNWA
3楼2011-05-21 09:45:44
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deblway

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
额。。。个人感觉楼主给的信息太少。。对照质粒的量（不是体积,大概多少ng）和酶切时用的都是多少。。。至于星活性会将质粒切的那么碎表示怀疑。。当然除非是时间超级长。。但我估计那么长时间酶活性也没了。。
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海贼王！哥当定了。。。。
4楼2011-05-21 15:45:20
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whiskyxy

金虫 (正式写手)
接着往下做做呗
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5楼2011-05-21 16:29:04
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meizishu

禁虫 (小有名气)
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6楼2011-05-22 09:24:21
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meizishu

禁虫 (小有名气)
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7楼2011-05-22 09:26:42
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meizishu

禁虫 (小有名气)
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8楼2011-05-23 20:22:23
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zhang304

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-05-23 22:23:21
引用回帖:
Originally posted by meizishu at 2011-05-22 09:24:21:
非常感谢您的回复！
DNA 5ul （从条带的亮度程度来估计的话，大约有25ng）
E1（takara的Hind III）:0.1ul
E2（takara的Kpn I）:0.1ul
buffer：1ul
ddH2O补足至10ul
酶切1h，37°。
选用10ul体系酶切就是 ...

一、紫外分光光度计测下DNA浓度计算质粒的量，选好两种酶兼容的buffer，Hind III单酶切应该没问题。如有，考虑提取的质粒有问题，建议重提质粒再做双酶切。
二、考虑下可能质粒根本就不是阳性质粒。
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9楼2011-05-23 21:19:19
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juaipingdong
10楼2011-05-23 21:22:37
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