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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 载体酶切
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yabxxh

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+3): good 2011-05-26 21:56:57
引用回帖:
Originally posted by meizishu at 2011-05-22 09:24:21:
非常感谢您的回复！
DNA 5ul （从条带的亮度程度来估计的话，大约有25ng）
E1（takara的Hind III）:0.1ul
E2（takara的Kpn I）:0.1ul
buffer：1ul
ddH2O补足至10ul
酶切1h，37°。
选用10ul体系酶切就是 ...

MM，你给的信息依然不是很全，首先请看以下信息：
HindIII在各种Universal Buffer中的相对活性：
               L        M         H         K      T（+BSA）
相对活性(%)   (60)    100    ＜20      200      (100)
KpnI在各种Universal Buffer中的相对活性：
               L      M        H        K     T（+BSA）
相对活性(%)   100    60    ＜20   ＜20      (100)
因此，你的最佳选择是加了BSA的T Buffer，如果你确实使用的T（+BSA），那么请提高你的内切酶的用量到每种酶0.5ul（不用这么省哈），酶切时间提高到3h（我用快速内切酶都切1h），这样应该不会有什么问题了。
好运
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11楼2011-05-24 10:16:05
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beautybanana

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+2): 有经验哦 2011-05-26 21:57:24
引用回帖:
Originally posted by meizishu at 2011-05-22 09:26:42:
非常感谢您的回复！
DNA 5ul （从条带的亮度程度来估计的话，大约有25ng）
E1（takara的Hind III）:0.1ul
E2（takara的Kpn I）:0.1ul
buffer：1ul
ddH2O补足至10ul
酶切1h，37°。

估算DNA的量我都是 ...

不知道你的操作技术怎么样，个人认为取0.1ul的量如果不是十分仔细将是很难的，你仔细看看枪头里的量0.2ul加在管壁上可以看到是一个很小的点，取0.1ul估计要难些，这个不熟练的话偏差将是很大的，说不定0.2,0.3ul的都有可能，把酶切体系适当增大些，以减少加样误差~当然实验条件要正确才行~
赞一下(2人) 回复此楼
12楼2011-05-26 18:10:31
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雪山飞狐7233

铁杆木虫 (著名写手)

铁杆小虫
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
都是很好的建议，我也学习了。
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梦在路就在！
13楼2011-05-26 19:33:00
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meizishu

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
14楼2011-05-27 08:49:17
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