应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 载体酶切
52/1返回列表
查看: 2516  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

meizishu

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽

» 猜你喜欢
1楼 2011-05-20 20:52:46
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yabxxh

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+3): good 2011-05-26 21:56:57
引用回帖:
Originally posted by meizishu at 2011-05-22 09:24:21:
非常感谢您的回复！
DNA 5ul （从条带的亮度程度来估计的话，大约有25ng）
E1（takara的Hind III）:0.1ul
E2（takara的Kpn I）:0.1ul
buffer：1ul
ddH2O补足至10ul
酶切1h，37°。
选用10ul体系酶切就是 ...

MM，你给的信息依然不是很全，首先请看以下信息：
HindIII在各种Universal Buffer中的相对活性：
               L        M         H         K      T（+BSA）
相对活性(%)   (60)    100    ＜20      200      (100)
KpnI在各种Universal Buffer中的相对活性：
               L      M        H        K     T（+BSA）
相对活性(%)   100    60    ＜20   ＜20      (100)
因此，你的最佳选择是加了BSA的T Buffer，如果你确实使用的T（+BSA），那么请提高你的内切酶的用量到每种酶0.5ul（不用这么省哈），酶切时间提高到3h（我用快速内切酶都切1h），这样应该不会有什么问题了。
好运
赞一下(2人) 回复此楼
11楼2011-05-24 10:16:05
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 14 个回答

yabxxh

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
1949stone(EPI+1): 来也 2011-05-21 12:39:37
呵呵，这个问题我以前遇见过。
既然你的对照质粒能跑出来，那说明质粒没问题。
为什么单酶切和双酶切都没有了呢，我们通常叫切碎了，因为你说的很简单，并没有给出酶切体系中各个成分的数据，以及酶切时间，哪个公司的何种内切酶，笼统分析如下：
1.你用的酶有星号活性，而你采用的是10ul体系，枪头随便沾上一点内切酶就会过量，尤其你做双酶切的时候，酶过量的结果就是甘油的浓度过大，然后内切酶产生星号活性，切碎了你的质粒。
2.你的酶切时间过长，切碎这种情况通常发生在过夜酶切的时候，中间的原因我就不说了，如果只是鉴定的话，建议快速内切酶酶切30min，普通内切酶3h。
3.你用的是快速内切酶，酶切时间过长。切碎的情况常见于快速内切酶，普通的也有，但是我和不幸的没有遇到过。
4.你没有好好研究内切酶说明书，忽略了说明书上的注意事项。
5.最不可能的情况，你选错了温度。
以上，好运
赞一下(2人) 回复此楼
2楼2011-05-21 09:28:09
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

deblway

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
额。。。个人感觉楼主给的信息太少。。对照质粒的量（不是体积,大概多少ng）和酶切时用的都是多少。。。至于星活性会将质粒切的那么碎表示怀疑。。当然除非是时间超级长。。但我估计那么长时间酶活性也没了。。
赞一下(1人) 回复此楼
海贼王！哥当定了。。。。
4楼2011-05-21 15:45:20
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

meizishu

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
6楼2011-05-22 09:24:21
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 14 个回答
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭