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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 载体酶切
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meizishu

禁虫 (小有名气)
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1楼 2011-05-20 20:52:46
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beautybanana

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+2): 有经验哦 2011-05-26 21:57:24
引用回帖:
Originally posted by meizishu at 2011-05-22 09:26:42:
非常感谢您的回复！
DNA 5ul （从条带的亮度程度来估计的话，大约有25ng）
E1（takara的Hind III）:0.1ul
E2（takara的Kpn I）:0.1ul
buffer：1ul
ddH2O补足至10ul
酶切1h，37°。

估算DNA的量我都是 ...

不知道你的操作技术怎么样，个人认为取0.1ul的量如果不是十分仔细将是很难的，你仔细看看枪头里的量0.2ul加在管壁上可以看到是一个很小的点，取0.1ul估计要难些，这个不熟练的话偏差将是很大的，说不定0.2,0.3ul的都有可能，把酶切体系适当增大些，以减少加样误差~当然实验条件要正确才行~
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12楼2011-05-26 18:10:31
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yabxxh

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
1949stone(EPI+1): 来也 2011-05-21 12:39:37
呵呵，这个问题我以前遇见过。
既然你的对照质粒能跑出来，那说明质粒没问题。
为什么单酶切和双酶切都没有了呢，我们通常叫切碎了，因为你说的很简单，并没有给出酶切体系中各个成分的数据，以及酶切时间，哪个公司的何种内切酶，笼统分析如下：
1.你用的酶有星号活性，而你采用的是10ul体系，枪头随便沾上一点内切酶就会过量，尤其你做双酶切的时候，酶过量的结果就是甘油的浓度过大，然后内切酶产生星号活性，切碎了你的质粒。
2.你的酶切时间过长，切碎这种情况通常发生在过夜酶切的时候，中间的原因我就不说了，如果只是鉴定的话，建议快速内切酶酶切30min，普通内切酶3h。
3.你用的是快速内切酶，酶切时间过长。切碎的情况常见于快速内切酶，普通的也有，但是我和不幸的没有遇到过。
4.你没有好好研究内切酶说明书，忽略了说明书上的注意事项。
5.最不可能的情况，你选错了温度。
以上，好运
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2楼2011-05-21 09:28:09
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deblway

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
额。。。个人感觉楼主给的信息太少。。对照质粒的量（不是体积,大概多少ng）和酶切时用的都是多少。。。至于星活性会将质粒切的那么碎表示怀疑。。当然除非是时间超级长。。但我估计那么长时间酶活性也没了。。
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海贼王！哥当定了。。。。
4楼2011-05-21 15:45:20
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meizishu

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
6楼2011-05-22 09:24:21
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