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meizishu

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zhang304

金虫 (小有名气)

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小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-05-23 22:23:21
引用回帖:
Originally posted by meizishu at 2011-05-22 09:24:21:
非常感谢您的回复!
DNA 5ul (从条带的亮度程度来估计的话,大约有25ng)
E1(takara的Hind III):0.1ul
E2(takara的Kpn I):0.1ul
buffer:1ul
ddH2O补足至10ul
酶切1h,37°。
选用10ul体系酶切就是 ...

一、紫外分光光度计测下DNA浓度计算质粒的量,选好两种酶兼容的buffer,Hind III单酶切应该没问题。如有,考虑提取的质粒有问题,建议重提质粒再做双酶切。
二、考虑下可能质粒根本就不是阳性质粒。
9楼2011-05-23 21:19:19
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yabxxh

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
1949stone(EPI+1): 来也 2011-05-21 12:39:37
呵呵,这个问题我以前遇见过。
既然你的对照质粒能跑出来,那说明质粒没问题。
为什么单酶切和双酶切都没有了呢,我们通常叫切碎了,因为你说的很简单,并没有给出酶切体系中各个成分的数据,以及酶切时间,哪个公司的何种内切酶,笼统分析如下:
1.你用的酶有星号活性,而你采用的是10ul体系,枪头随便沾上一点内切酶就会过量,尤其你做双酶切的时候,酶过量的结果就是甘油的浓度过大,然后内切酶产生星号活性,切碎了你的质粒。
2.你的酶切时间过长,切碎这种情况通常发生在过夜酶切的时候,中间的原因我就不说了,如果只是鉴定的话,建议快速内切酶酶切30min,普通内切酶3h。
3.你用的是快速内切酶,酶切时间过长。切碎的情况常见于快速内切酶,普通的也有,但是我和不幸的没有遇到过。
4.你没有好好研究内切酶说明书,忽略了说明书上的注意事项。
5.最不可能的情况,你选错了温度。
以上,好运
2楼2011-05-21 09:28:09
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deblway

铜虫 (初入文坛)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
额。。。个人感觉楼主给的信息太少。。对照质粒的量(不是体积,大概多少ng)和酶切时用的都是多少。。。至于星活性会将质粒切的那么碎表示怀疑。。当然除非是时间超级长。。但我估计那么长时间酶活性也没了。。
海贼王!哥当定了。。。。
4楼2011-05-21 15:45:20
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meizishu

禁虫 (小有名气)

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6楼2011-05-22 09:24:21
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