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求助：real-time PCR数据结果如何处理？
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开始学习做Realtime PCR, 实验结果是出来了，得到的内参、目的基因的Ct值在15-25之间，熔融曲线基本上也是单峰，但不太会处理这个结果，对着数据发愁。。。不同的处理方法得到不同的结果。。。 做的是相对定量，SYBR Green, 选用2^（-△△Ct）法 一般大家是怎么处理的呢？比方实验设置如下： 内参基因：对照组1、对照组2、对照组3 实验组1、实验组2、实验组3 目的基因：对照组1、对照组2、对照组3 实验组1、实验组2、实验组3 数据处理的时候，是先分别取内参、目的基因的三次平行实验的均值再拿相应均值相减得到△Ct，还是先算每组△Ct(目的基因-内参基因）后再取平均？ 还有对于内参基因的数据，是否可以将所有的内参取平均，然后△Ct值就拿每个组的目的基因减去这个内参均值？ 对于内参的CT值怎样的数据算比较好呢？一般组间、组内CT差值在多少比较合理？ 另外对于这个REAL-TIME PCR的结果除了用EXCEL处理之外有没有其他比较可信方便的专业处理软件呢？ |
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zhuifeng7000
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【答案】应助回帖
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silicare(金币+8, EPI+1): very good 2011-05-22 16:02:26
happy-j(金币+1): 2011-05-24 11:48:46
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首先你要理解2^（-△△Ct 这个公式： 第一个△ 是目的基因减内参基因endogenous control.目的就是排除组内差异啦（内参的功能嘛）。 第二个△是第一个△的值减去对照组 reference sample.目的就是在比较时找一个标准（表达量是比它高呢还是低呢） 这个2就是默认扩展效率为1时，PCR每循环扩增的倍数了。 明白了上面的，你还要在软件设置： 1.replicates。就是重复次数啦，最少2次。 2.biological relicate groups .生物学重复次数。这个就是你实验重复次数。建议3次以上。 设置好以上（英文单词）选项，各种牌子的机子自带的软件就能帮你算出结果，并且绘制出表达差异柱状图。 PS. 你画的那个实验图。我理解实验组1,2,3，是3种不同处理。而对照1,2,3，也不相同。 这样会绘制3个柱状图。分别是每个处理组相对它对应的对照组的柱状图。 它的计算过程是：△△Ct=（CT实验组1-CT实验组1内参）-（CT对照组1-CT对照组1内参）。得到的是目的基因在实验组1条件下相对对照组1的表达量。比方说X基因在给药后A后提高了5倍表达。同理你2,3，实验的结论是：在给药B,C后表达调高几倍。 最后，再次强调，这是计算机会自己算的。你只要设置好这些。另外额外提示：△△Ct法要求引物扩展效率一致。要提前做这个预实验哦。 祝实验顺利。 |
3楼2011-05-21 22:52:02