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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求，原核表达相关问题？
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475502411

铜虫 (著名写手)

[求助] 求，原核表达相关问题？

各位大侠：
  我的目的基因和表达载体pet-41a不知道为什么连接不上？
  我已验证不是感受态，连接酶的问题
  另外，酶切回收后也跑了电泳，条带虽不是太亮，但感觉还可以
  阳性也可以做出来
  请各位指教！！！

[ Last edited by dhd997 on 2011-4-24 at 08:40 ]
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
1楼 2011-04-23 21:17:01
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
最好把实验步骤说详细些吧。比如你的连接体系和反应条件是怎么样的？
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2楼2011-04-23 21:54:39
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roomofxw

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): good 2011-04-24 09:56:59
475502411(金币+4): 2011-04-27 15:02:10
475502411(金币+6): 2011-05-01 10:26:37
要是确认不是连接，转化过程的问题
请设计实验，验证
1.质粒上多克隆位点是否正确，能不能酶切开，这可以通过分别单酶切，测序来验证
2.引物设计是否有问题，或者是否合成引物有问题，酶切位点没有了。
3.验证方法是否合适，仅仅是菌落PCR是不可以的。
但是若是，PCR产物连接到T载体上，再酶切下来，载体的酶切也没有问题……
咕~~(╯﹏╰)b
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3楼2011-04-24 09:12:47
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475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-04-23 21:54:39:
最好把实验步骤说详细些吧。比如你的连接体系和反应条件是怎么样的？

T4连接酶           1
连接液               1
目的片段            6
PET-41a             2
过夜连接和24小时16度连接都做了，没结果
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
4楼2011-04-26 19:56:05
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475502411

铜虫 (著名写手)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励补充问题 2011-04-26 20:19:15
引用回帖:
Originally posted by roomofxw at 2011-04-24 09:12:47:
要是确认不是连接，转化过程的问题
请设计实验，验证
1.质粒上多克隆位点是否正确，能不能酶切开，这可以通过分别单酶切，测序来验证
2.引物设计是否有问题，或者是否合成引物有问题，酶切位点没有了。
3.验证 ...

我是先连接的T载体，然后酶切，与表达载体pet-41a酶切后连接的
连接体系10微升
T4连接酶                    1
连接液                        1
目的片段                     6
表达载体                     2
16度过夜后转入感受态细胞，感受态没问题
酶切后目的基因和表达载体都跑了电泳，酶切没有问题
我想问题还是在连接上，但是还不知道哪儿出问题了
敬请指教！！！！！！！！！！！！
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
5楼2011-04-26 20:00:47
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jlc0225

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

475502411(金币+2): 2011-04-26 21:00:12
引用回帖:
Originally posted by 475502411 at 2011-04-26 20:00:47:
我是先连接的T载体，然后酶切，与表达载体pet-41a酶切后连接的
连接体系10微升
T4连接酶                    1
连接液                        1
目的片段                     6
表达载体               ...

1、可以试试不同的连接比例
2、使用连接试剂盒
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6楼2011-04-26 20:13:29
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jlc0225

至尊木虫 (著名写手)
别急，有些实验是永远不知道为什么出了问题，但是突然间一切都会顺利。着急只会使思路更乱。

如果你的问题确定在连接上，那么就要把有关连接的因素一一找出来。有时要重新配置或更换试剂，酶的生产厂家可以更换，或者向销售的要酶的试用装。也可以严格一下操作的环境，如在超净台上操作。

总之，成功了就没有问题，如果出了问题那就各个方面都要考虑。
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7楼2011-04-26 20:21:57
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475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by jlc0225 at 2011-04-26 20:21:57:
别急，有些实验是永远不知道为什么出了问题，但是突然间一切都会顺利。着急只会使思路更乱。

如果你的问题确定在连接上，那么就要把有关连接的因素一一找出来。有时要重新配置或更换试剂，酶的生产厂家可以更换 ...

恩，我再好好思考一下，谢谢你！
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8楼2011-04-26 20:59:49
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roomofxw

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

475502411(金币+4): 2011-04-26 22:24:48
引用回帖:
Originally posted by 475502411 at 2011-04-26 20:00:47:
我是先连接的T载体，然后酶切，与表达载体pet-41a酶切后连接的
连接体系10微升
T4连接酶                    1
连接液                        1
目的片段                     6
表达载体               ...

1.你指的连接不上，是指平板没有菌，还是都是自连
2.想验证你的连接体系，你就拿别人的质粒和片段连一下试一试。或者把质粒，但单酶切后再连。
3.转的什么感受态
4.你的目的基因代表的蛋白，会对e.coli产生很强的毒性吗
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9楼2011-04-26 21:41:07
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475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by roomofxw at 2011-04-26 21:41:07:
1.你指的连接不上，是指平板没有菌，还是都是自连
2.想验证你的连接体系，你就拿别人的质粒和片段连一下试一试。或者把质粒，但单酶切后再连。
3.转的什么感受态
4.你的目的基因代表的蛋白，会对e.coli产生 ...

1.平板上没长菌落，不知道是自连还是没连接上
2.我想先转到DH5a中，然后高拷贝提取质粒后，再转到BL21，因为我怕直接转BL21因连接的质粒少，不好转
3.目的基因产生的蛋白对大肠没有任何毒性
目前就卡在连接上了
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10楼2011-04-26 22:24:32
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