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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 5‘Race扩不出带，求高手指点
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waterchen

银虫 (正式写手)

[求助] 5‘Race扩不出带，求高手指点

本人最近做5‘Race，得到如下图。望高手解释下可能问题出在哪里呢？先在此谢过了。
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1楼 2011-04-18 01:44:02
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waterchen

银虫 (正式写手)
自己先顶，坐等高手出现。急就一个字。
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2楼2011-04-18 09:05:09
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): good 2011-04-18 10:58:27
waterchen(金币+1): 谢谢 2011-04-25 19:10:52
就一条GSP吗？做5RACE最好用高GC的PCR试剂
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3楼2011-04-18 09:11:54
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sai00fuji

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by shaquila at 2011-04-18 09:11:54:
就一条GSP吗？做5RACE最好用高GC的PCR试剂

GSP是什么
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4楼2011-04-18 11:10:28
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beibei9535

荣誉版主 (职业作家)

晕晕小版主~ 姑娘你好！

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

建议做touch up PCR.
从50℃开始涨到65℃。
从而逐渐定位一条条带。如果仍然不清晰，建议切下主要条带，做二次PCR.

学会二次PCR 的应用。
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最好的年龄是，那一天，终于知道并且坚信自己有多好，不是虚张，不是夸浮，不是众人捧，是内心明明澈澈知道：是的，我就是这么好。
5楼2011-04-18 11:31:30
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shaquila

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by sai00fuji at 2011-04-18 11:10:28:
GSP是什么

特异性引物
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6楼2011-04-18 13:49:02
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
Originally posted by waterchen at 2011-04-18 01:44:02:
本人最近做5‘Race，得到如下图。望高手解释下可能问题出在哪里呢？先在此谢过了。

根据我的经验，如果是5race，做第一次pcr时候很难获得清晰条带，而且即使有带，也大部分是rRNA，这些条带做二次pcr依旧清晰无比，测序回来才发现悲剧
除非你的pcr酶，引物，模版都很好，所以我不大建议做td或者摸索条件，这会耗费大量时间
而是用nested pcr，多设计引物，第一轮把所有gsp用55或者60做pcr（根据引物tm确定退火，别把退火弄得太高，很多manual说要把tm设计>70，除非你不做nested pcr，想一次出带，否则无所谓），如果结果不是空白，把product稀释100－200 倍，用inner gsp进行pcr，如果有清晰的带，恭喜你拉
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7楼2011-04-18 13:57:58
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szylnl

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by sai00fuji at 2011-04-18 11:10:28:
GSP是什么

Gene special Primer
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用百分之百的努力去做每件事
8楼2011-04-18 15:37:58
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szylnl

银虫 (小有名气)
小弟也准备做RACE 请问楼主是用的哪家的试剂盒啊？？？
谢谢，
祝实验成功
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用百分之百的努力去做每件事
9楼2011-04-18 15:40:04
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waterchen

银虫 (正式写手)
宝生物买的盒子clonetech。太贵了。烧不起啊。
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10楼2011-04-18 16:19:21
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