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waterchen

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[求助] 5‘Race扩不出带，求高手指点

本人最近做5‘Race，得到如下图。望高手解释下可能问题出在哪里呢？先在此谢过了。

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1楼 2011-04-18 01:44:02

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shaquila

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【答案】应助回帖

引用回帖:

Originally posted by waterchen at 2011-04-18 01:44:02:
本人最近做5‘Race，得到如下图。望高手解释下可能问题出在哪里呢？先在此谢过了。

根据我的经验，如果是5race，做第一次pcr时候很难获得清晰条带，而且即使有带，也大部分是rRNA，这些条带做二次pcr依旧清晰无比，测序回来才发现悲剧
除非你的pcr酶，引物，模版都很好，所以我不大建议做td或者摸索条件，这会耗费大量时间
而是用nested pcr，多设计引物，第一轮把所有gsp用55或者60做pcr（根据引物tm确定退火，别把退火弄得太高，很多manual说要把tm设计>70，除非你不做nested pcr，想一次出带，否则无所谓），如果结果不是空白，把product稀释100－200 倍，用inner gsp进行pcr，如果有清晰的带，恭喜你拉