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waterchen

银虫 (正式写手)

[求助] 5‘Race扩不出带,求高手指点

本人最近做5‘Race,得到如下图。望高手解释下可能问题出在哪里呢?先在此谢过了。
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
Originally posted by waterchen at 2011-04-18 01:44:02:
本人最近做5‘Race,得到如下图。望高手解释下可能问题出在哪里呢?先在此谢过了。

根据我的经验,如果是5race,做第一次pcr时候很难获得清晰条带,而且即使有带,也大部分是rRNA,这些条带做二次pcr依旧清晰无比,测序回来才发现悲剧
除非你的pcr酶,引物,模版都很好,所以我不大建议做td或者摸索条件,这会耗费大量时间
而是用nested pcr,多设计引物,第一轮把所有gsp用55或者60做pcr(根据引物tm确定退火,别把退火弄得太高,很多manual说要把tm设计>70,除非你不做nested pcr,想一次出带,否则无所谓),如果结果不是空白,把product稀释100-200 倍,用inner gsp进行pcr,如果有清晰的带,恭喜你拉
7楼2011-04-18 13:57:58
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waterchen

银虫 (正式写手)

自己先顶,坐等高手出现。急就一个字。
2楼2011-04-18 09:05:09
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): good 2011-04-18 10:58:27
waterchen(金币+1): 谢谢 2011-04-25 19:10:52
就一条GSP吗?做5RACE最好用高GC的PCR试剂
3楼2011-04-18 09:11:54
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sai00fuji

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by shaquila at 2011-04-18 09:11:54:
就一条GSP吗?做5RACE最好用高GC的PCR试剂

GSP是什么
4楼2011-04-18 11:10:28
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