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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 【求助/交流】不产孢的真菌如何计算接种量
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gengpeng

铁虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】不产孢的真菌如何计算接种量

想利用摇瓶发酵获取真菌代谢物的最佳发酵条件，但目标菌非产孢真菌，如何确定接种量！
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1楼2011-04-15 09:55:54
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)
怎么确定这个菌不产孢子？仅靠平板培养不产孢子还是这个物种（物种分类学定义，不是菌种）不产？
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2楼2011-04-15 10:40:43
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newtime007

木虫 (正式写手)
★
rainwander(金币+1): 鼓励积极参与讨论交流~~ 2011-04-15 17:51:34
你不是要摸索最佳发酵条件吗？接种量本身就是一个参数。不管是孢子接种还是菌丝接种都是一个数据，是根据你的发酵体系而定的数据，菌丝你可以离心称重。准确的话就做个干重与湿重曲线。不准确直接用湿重
当否？
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3楼2011-04-15 10:53:46
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郝钊

金虫 (小有名气)
★
rainwander(金币+1): 鼓励积极参与讨论交流~~ 2011-04-15 17:51:43
这个问题很多童鞋都会遇到，丝状真菌生物量的测定一直困扰着大家。不过你做发酵，不需要太精确，只是看接种量的影响。那就用打孔器从培养好的平板上连同培养基一起接种，接种不同数量就可以了。
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4楼2011-04-15 14:23:26
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gengpeng

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 郝钊 at 2011-04-15 14:23:26:
这个问题很多童鞋都会遇到，丝状真菌生物量的测定一直困扰着大家。不过你做发酵，不需要太精确，只是看接种量的影响。那就用打孔器从培养好的平板上连同培养基一起接种，接种不同数量就可以了。

谢谢楼上，请问用湿菌丝称重如何保证不被污染，用打孔器打下菌饼接种有没有相关文献支持，谢谢
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5楼2011-04-16 07:57:04
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郝钊

金虫 (小有名气)
★
rainwander(金币+1): 鼓励交流~ 2011-04-17 15:02:26
gengpeng(金币+1): 2011-04-25 22:32:26
离心管事先称重，离心收集完菌体后弃去上清，称重。这些操作在超净台里完成就可以了。我没有做过丝状真菌接种，是楼上一个师兄在做，我手头没有这方面的文献，回头我可以帮你问一问他。
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6楼2011-04-16 09:39:42
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)
看样子我是被晾在一边了，那我就一边凉快去了，天热，还是凉快点的好。
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7楼2011-04-16 20:29:45
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lkphg

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
冼亮淀粉酶 大侠，我顶你一下。这个情况我也遇到过，比如有的真菌虽然产孢，产在培养基内，或在载孢器里，难以用孢子接种来确定接种量，所以先谢谢冼亮淀粉酶 大侠，也期待郝钊 大侠的最新答复。
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8楼2011-04-19 09:52:37
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lkphg

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
帖子别沉了，楼上几位的方法学习了，还有别的好方法吗？期待啊！
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9楼2011-04-23 16:38:49
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myindexaust

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
rainwander(金币+1): 鼓励交流 2011-04-25 21:40:20
接种一定面积的带菌琼脂块，或者一定重量（换算干重）的新鲜菌丝。目前来说就是这两种个方法。都有文献支持的。
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10楼2011-04-25 20:59:13
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plumplumgxc

金虫 (正式写手)
用打孔器就行了，很常规的做法
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11楼2011-04-27 10:55:59
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shenmofeng

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
rainwander(金币+2): 鼓励交流 2011-04-27 19:46:29
我们刚刚在做黑曲霉的发酵，啥都不懂，也是被生物量如何测定困扰着
我们的发酵液主要是木薯液化液，有很多木薯渣，如果用离心或者抽滤再称干重的话，大量木薯渣会和菌丝体混在一起。。。。于是我们想用一个只接种不发酵的空白，测一测发酵液的干重，再拿待测样品的干重一减当做菌体干重，其实这样也是非常不准的，毕竟单位体积里的木薯渣含量是不可能一样的。。。
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12楼2011-04-27 14:00:14
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)
引用回帖:
Originally posted by shenmofeng at 2011-04-27 14:00:14:
我们刚刚在做黑曲霉的发酵，啥都不懂，也是被生物量如何测定困扰着
我们的发酵液主要是木薯液化液，有很多木薯渣，如果用离心或者抽滤再称干重的话，大量木薯渣会和菌丝体混在一起。。。。于是我们想用一个只接 ...

这个实验的目的和设计是怎样的
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13楼2011-04-27 15:53:27
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shenmofeng

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-04-27 15:53:27:
这个实验的目的和设计是怎样的

是用黑曲霉做柠檬酸摇瓶发酵，碳源是木薯液化液（未去渣）。我们实验室之前没做过这块的，所以小弟完全是摸着石头过河，这才刚刚开始摸索发酵条件，想通过定时测菌体量来看看黑曲霉大概的生长曲线，找找对数期什么的，情况就是这样的。
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14楼2011-04-28 10:19:12
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lkphg

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
Originally posted by shenmofeng at 2011-04-28 10:19:12:
是用黑曲霉做柠檬酸摇瓶发酵，碳源是木薯液化液（未去渣）。我们实验室之前没做过这块的，所以小弟完全是摸着石头过河，这才刚刚开始摸索发酵条件，想通过定时测菌体量来看看黑曲霉大概的生长曲线，找找对数期 ...

为什么不去渣，用离心机离心一下不就没事了？
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15楼2011-04-28 12:23:27
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
木薯淀粉液化醪的成分也是挺复杂的，是由木薯淀粉粉碎之后过筛、调浆、加入耐高温alpha淀粉酶、高温蒸煮而得。耐高温alpha淀粉酶是由芽孢杆菌所产，最适作用温度超过90度，不是生淀粉酶，不能降解生淀粉。木薯生淀粉晶体在50度开始被破坏，随着温度升高，糊化速度加快，同时耐高温alpha淀粉酶活力上升。在蒸煮的过程中酶逐渐失活，最终得到液化醪。液化醪主要含有的糖的成分随淀粉酶的降解程度而异，在酒精生产中的液化醪主要含有麦芽寡糖、麦芽糖和少量葡萄糖。木薯淀粉的淀粉含量随木薯品种和季节而异，鲜木薯含量一般为30%，干品（约含10%水分）一般为70%甚至更高，剩下的都是纤维素木质素之类的不能利用的东西。离心也是可行的，但是有两个问题要注意：
1、会把一部分糖分也去掉，但是由于糖分都已经是可溶解了，所以去掉的不多
2、在中试的时候难操作，量多难操作，中试的发酵罐可能会有50升甚至两百升，需要的液化醪较多。

好处也是有的，可以测定生物量。生物量是一项辅助数据，可以获得就最好也获得，可以看看产量的变化是否因为生物量的变化引起的。但是凡事都应该以产量为唯一可比较的指标。还有一个好处是方便产物的提取，渣多不好提取，但是如果只是优化一下实验条件又不用提取的，就别考虑这么多了。

所以我觉得离心是最好的，有的东西离心去不掉，就过滤。但是如果要求不高，那就算了。
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16楼2011-04-28 14:59:38
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shenmofeng

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-04-28 14:59:38:
木薯淀粉液化醪的成分也是挺复杂的，是由木薯淀粉粉碎之后过筛、调浆、加入耐高温alpha淀粉酶、高温蒸煮而得。耐高温alpha淀粉酶是由芽孢杆菌所产，最适作用温度超过90度，不是生淀粉酶，不能降解生淀粉。木薯生淀 ...

明白了，3q！
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17楼2011-04-28 15:18:10
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)
no use to 3q me
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18楼2011-04-28 15:21:12
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cc1000ml

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
不产孢子的丝状真菌...第一次听说，LZ能具体说下么...
    LZ的问题是不是其实有两个
  1：接种量无法确定的问题.
   2：发酵过程中测菌体重量的问题
  接种量的问题，其实要看LZ要求的精度有多高了。要是不高的话，个人觉得打饼就可以了，称重感觉比较容易染菌。
  现在我做发酵是先挑一环到两环菌丝到种子培养基中，活化之后再接发酵，接种量是种子培养基的10%或5%，这样保证一批是相同浓度.
   其实最终涉及到的还是要求精度的问题，因为无论采取哪种方法，有些变量都无法控制，譬如打饼的位置，接种菌丝，以及其他一些影响.
   称量菌体的问题，没想到好的办法，不过有人帮忙解决了，嘿嘿.
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19楼2011-04-28 17:27:13
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lkphg

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
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Originally posted by cc1000ml at 2011-04-28 17:27:13:
不产孢子的丝状真菌...第一次听说，LZ能具体说下么...
    LZ的问题是不是其实有两个
  1：接种量无法确定的问题.
   2：发酵过程中测菌体重量的问题
  接种量的问题，其实要看LZ要求的精度有多高了。要是不高 ...

我和LZ是遇到同样的问题，也和LZ交流过，我替LZ解释一下吧，不是不产孢子，而是孢子很难形成，而且产在载孢体里，无法以孢子数作为接种量的量化指标。我有3个问题：
1、如果采用打饼的话如何量化？是否可以说成100mL发酵培养基加入2个、3个菌饼？
2、接种量是种子培养基的10%或5%作何解？是指含菌丝的种子培养基占发酵培养基的10%或5%吗？或是以10%或5%的种子培养基接入发酵培养基。但如果菌丝成团而不分散均匀的话，这个方法似乎不准确啊。
3、中试发酵罐为50升，此时如何确定接菌量？
谢谢cc1000ml 以及楼上各位。
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20楼2011-04-29 01:06:10
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cc1000ml

金虫 (正式写手)
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Originally posted by lkphg at 2011-04-29 01:06:10:
我和LZ是遇到同样的问题，也和LZ交流过，我替LZ解释一下吧，不是不产孢子，而是孢子很难形成，而且产在载孢体里，无法以孢子数作为接种量的量化指标。我有3个问题：
1、如果采用打饼的话如何量化？是否可以说 ...

1 个人想法：  打饼所谓的量化（接2个或者3个菌饼）只能是相对的，只能保证同一批次的相同，因为平板由于接种等因素的影响，不可能完全相同，所谓的打饼量化应该比较适用于对量化指标要求不高的情况下.
   2 10%或5%的接种量是针对种子培养基的体积而言，例如：100ML的种子培养基，每个发酵瓶接10ML. 涉及到接种量是否一致的问题，不知道你们的菌是什么情况，我一般是抛弃菌丝体，直接取上清...这样就能保证吸到的是均匀的孢子液。不过这个针对这种孢子很难形成的菌 是否有很大困难.
  3 现在没有做过上罐实验 所以不清楚了哈
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21楼2011-04-29 09:00:54
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lkphg

金虫 (小有名气)
★
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Originally posted by cc1000ml at 2011-04-29 09:00:54:
1 个人想法：  打饼所谓的量化（接2个或者3个菌饼）只能是相对的，只能保证同一批次的相同，因为平板由于接种等因素的影响，不可能完全相同，所谓的打饼量化应该比较适用于对量化指标要求不高的情况下.
   2  ...

我们的真菌确实较难产孢，即使摇床培养1个多月形成载孢体，里面也不一定有孢子，有点邪门。呵呵，不过学习了。
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22楼2011-04-29 09:18:20
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lkphg

金虫 (小有名气)
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
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Originally posted by myindexaust at 2011-04-25 20:59:13:
接种一定面积的带菌琼脂块，或者一定重量（换算干重）的新鲜菌丝。目前来说就是这两种个方法。都有文献支持的。

可否给文献的出处？谢谢啦！
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23楼2011-04-29 09:23:16
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flightty

木虫 (正式写手)
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Originally posted by lkphg at 2011-04-29 09:18:20:
我们的真菌确实较难产孢，即使摇床培养1个多月形成载孢体，里面也不一定有孢子，有点邪门。呵呵，不过学习了。

很多真菌就是不产孢子，也有很多需要在非常严格的条件下才能产生孢子。这类真菌接种时只能接种相当大小的面积的菌落，并且菌落最好用组织研磨器研碎。这种接种方式实际上只对菌块直接接发酵的发酵过程有很大影响。如果你的发酵工艺需要2级种子或者更多级的种子，在种子生长过程中会将菌块大小所造成的接种量误差消除。
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24楼2011-04-29 11:09:23
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匿名

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25楼2012-05-05 21:56:04
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cc1000ml

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1262049楼: Originally posted by 刘琴英阮昆 at 2012-05-05 21:56:04:
"我一般是抛弃菌丝体，直接取上清...？？？""

这个如何做到？

谢谢！！

静置，菌丝体会沉下去，吸取上清。
或者离心，但是离心速度不能太高，菌丝体一般都在下面，孢子比较轻，在上清。
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26楼2012-05-06 13:48:32
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launol

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1132375楼: Originally posted by cc1000ml at 2011-04-28 17:27:13
不产孢子的丝状真菌...第一次听说，LZ能具体说下么...
    LZ的问题是不是其实有两个
  1：接种量无法确定的问题.
   2：发酵过程中测菌体重量的问题
  接种量的问题，其实要看LZ要求的精度有多高了。要是不高的 ...

我想问下，后来是怎么解决的关于种子液接种到发酵培养基中的问题的，就是种子液的接种量怎么控制（菌丝球会影响接种量）
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27楼2012-09-29 16:09:11
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