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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】请问各位，如何研究转化后质粒在宿主体内的稳定性？
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nancyyazi

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】请问各位，如何研究转化后质粒在宿主体内的稳定性？ 已有8人参与

各位前辈，我现在将含gfp的重组质粒转到细菌中，加了IPTG，在自然光下菌落就呈现了绿色，可是问题来了，我要怎么设计我得筛选实验才能比较全面的分析并得到一个稳定的菌株呢？
通常研究质粒的稳定性哪种方法比较权威？
质粒在甘油菌中保存，是不是甘油会对质粒产生影响？到底多大浓度甘油保存比较合适呢？
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1楼 2011-04-07 15:49:29
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yesucao

木虫 (正式写手)
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西瓜(金币+4): good 2011-04-19 14:02:50
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Originally posted by nancyyazi at 2011-04-07 16:31:06:
怎样算做50代？平板划线还是直接反复摇菌？

过夜活化菌株，按0.1%接种无抗生素LB培养基，30℃，振荡培养5h，再以0.1%接种无抗生素的LB培养基，按上述相同条件下培养，连续重复培养50h，最后一次培养液涂布LB平板，随机挑取300个转化子转入抗生素平板，以抗性菌株所占百分比计算工程菌的遗传稳定性。
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14楼2011-04-19 08:54:19
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yesucao

木虫 (正式写手)
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dhd997(金币+3): 鼓励交流 2011-04-08 08:45:53
呵呵，我目前也是做这个的，我看到的文献是连续多次传代（50次）观察质粒稳定性，一般用30%的甘油，1:1的比例保藏质粒，
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2楼2011-04-07 16:25:09
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nancyyazi

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yesucao at 2011-04-07 16:25:09:
呵呵，我目前也是做这个的，我看到的文献是连续多次传代（50次）观察质粒稳定性，一般用30%的甘油，1:1的比例保藏质粒，

怎样算做50代？平板划线还是直接反复摇菌？
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3楼2011-04-07 16:31:06
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
传代，划平板
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4楼2011-04-07 16:48:54
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nancyyazi

铜虫 (小有名气)
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amisking(金币+1): 鼓励发帖交流。 2011-04-07 20:02:30
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Originally posted by lxj341401 at 2011-04-07 16:48:54:
传代，划平板

一块平板上长了很多单菌落，有的可能没有表达，还有有的可能更绿一些有的浅一些，选哪种单菌落继续划线？
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5楼2011-04-07 16:58:18
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郝钊

金虫 (小有名气)
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amisking(金币+1): 鼓励发帖交流。 2011-04-07 20:02:25
我也在做GFP，确实出现了传代之后菌种退化的现象，挑取的绿色菌落培养后涂平板或者划线，结果发现有一多半都没有了绿色。之前做过传代，没问题，涂平板后都是绿色，现在出现退化了，郁闷。
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6楼2011-04-07 17:23:55
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nancyyazi

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 郝钊 at 2011-04-07 17:23:55:
我也在做GFP，确实出现了传代之后菌种退化的现象，挑取的绿色菌落培养后涂平板或者划线，结果发现有一多半都没有了绿色。之前做过传代，没问题，涂平板后都是绿色，现在出现退化了，郁闷。

是把发绿光的单菌落保种后，几个月后再活化发现质粒丢失一半了？
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7楼2011-04-07 20:30:28
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
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dhd997(金币+2): 仔细点 2011-04-08 08:46:26
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Originally posted by nancyyazi at 2011-04-07 16:58:18:
一块平板上长了很多单菌落，有的可能没有表达，还有有的可能更绿一些有的浅一些，选哪种单菌落继续划线？

挑取的绿色菌落培养后涂平板或者划线
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8楼2011-04-08 07:43:03
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郝钊

金虫 (小有名气)
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dhd997(金币+1): 鼓励交流 2011-04-08 13:24:31
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Originally posted by nancyyazi at 2011-04-07 20:30:28:
是把发绿光的单菌落保种后，几个月后再活化发现质粒丢失一半了？

在平板上养着，四度保存的，隔了一个多月吧。但是后来挑的是绿色的单菌落啊。
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9楼2011-04-08 11:33:09
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nancyyazi

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 郝钊 at 2011-04-08 11:33:09:
在平板上养着，四度保存的，隔了一个多月吧。但是后来挑的是绿色的单菌落啊。

我把菌液在4度放了几天，再划线质粒保存率明显小了，就是绿色的相对少了，更何况你平板放了一个月，不知道再活化之后会不会好些？
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10楼2011-04-10 12:51:28
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