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足下客

木虫 (正式写手)

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1楼2011-04-06 09:50:34

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足下客

木虫 (正式写手)

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引用回帖:

Originally posted by amilie030312 at 2011-04-06 12:53:59:
1、分不同的组织加入不同的裂解液（不需要抽提RNA）
2、加入杂交探针过夜杂交（同一样本多个基因检测的探针在一起）
3、洗涤未杂交上的多余探针，放入信号放大探针杂交，洗涤，加入标记探针杂交，洗涤，加入荧光 ...

最后一步给出倍比关系，应该是有个参照的吧，就是文献中说的内标。不知道这个内标是如何选取的呢，用的是什么组织中的RNA呢？还有这个内标的浓度是如何控制的，需不需要做标准曲线之类的呢？
再就是做内标用的RNA与待测的RNA是放在同一个孔中检测，还是不同的孔中检测？

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3楼2011-04-06 13:39:31

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amilie030312

金虫 (正式写手)

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★ ★ ★ ★
足下客(金币+1): 谢谢你的参与 2011-04-06 13:41:04
1949stone(金币+4): 鼓励 2011-04-06 14:03:11
足下客(金币+1): 2011-06-29 17:14:23

1、分不同的组织加入不同的裂解液（不需要抽提RNA）
2、加入杂交探针过夜杂交（同一样本多个基因检测的探针在一起）
3、洗涤未杂交上的多余探针，放入信号放大探针杂交，洗涤，加入标记探针杂交，洗涤，加入荧光染料，洗涤。
4、加入度数Buffer杂交5分钟，上机读数。
5、仪器自动给出代表基因表达量倍比关系的荧光值结果。

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2楼2011-04-06 12:53:59

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amilie030312

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★ ★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+6): good 2011-04-06 15:04:10
足下客(金币+5): 非常感谢，明白多了 2011-04-06 15:13:53
足下客(金币+1): 2011-06-29 17:14:30

引用回帖:

Originally posted by 足下客 at 2011-04-06 13:39:31:
最后一步给出倍比关系，应该是有个参照的吧，就是文献中说的内标。不知道这个内标是如何选取的呢，用的是什么组织中的RNA呢？还有这个内标的浓度是如何控制的，需不需要做标准曲线之类的呢？
再就是做内标用的 ...

这个技术是和QPCR完全不同的原理的，也有内参基因，说明书上给出了很多个表达登记的内参基因，如果要做绝对定量那肯定是要做标曲的，但大家通常在做QPCR的时候做的是相对定量。这种技术是把不同基因的探针（包括看家基因的探针）放在一个样本里来进行杂交的。所以最后数据统计的时候先把不同样本之中的看家基因统一了，然后再在每一个样本当中不同基因和看家基因再计算一个相对表达量的值，所以不做标曲就做的是相对定量。
做QPCR只有做病毒的是会做绝对定量的，其他做的基本都是相对定量。

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4楼2011-04-06 14:12:15

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