应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】怎么做都提不出DNA，请高手帮一下忙喽！！！！
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
533/6返回列表上一页123456下一页
查看: 3272  |  回复: 52
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 2 个 MolEPI ，点击这里进行查看

鬼笔坏坏

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-04-15 23:37:54:
楼主上图，提取得到的样品的电泳图，看看有没有什么RNA和DNA，别忘了点上两个ladder，λ 线性DNA用于指示青霉DNA，1kb DNA 用于指示RNA。当然，如果有经验了，就点上这两个中的一个就可以了。附上我的一张电泳图， ...

真好，这么多DNA，我们成像系统要过几天才能过来，我提出来的也是好多RNA，就是那种拖尾，如果有RNA是不是说细胞都破壁了啊？
赞一下 回复此楼
21楼2011-04-16 07:23:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(EPI+1): 哈哈 epi来也 2011-04-21 12:58:46
如果有了RNA，当然就是表示已经破胞成功了，因为细胞内才有RNA。

我用的抽提液配方为
成分        浓度
NaCl        200mmol/L
EDTA-Na2        4mmol/L
SDS        2%
Tris-HCl(pH=8.0)        100mmol/L

与你的不一样，我用的方法和你的也不一样
2.4.14.1真菌总DNA的提取
（1）接种菌株至液体培养基中，28℃，180rpm振荡培养3天；
（2）用灭菌纱布过滤，并压干菌体；
（3）将菌丝体倒入研钵（灭菌并预冷），迅速倒入液氮，研磨至粉末状；
（4）将粉末移至1.5mL的EP管中，加入600µL真菌提取液；
（5）加等体积苯酚/氯仿，轻轻倒转混合，10000rpm离心10min；
（6）取400µL上清液移入新的1.5mlLEP管，重复步骤（5）之后以等体积氯仿抽提一次；
（7）取上清液，加入两倍体积无水乙醇，-20℃放置30min；
（8）10000rpm 离心10min，75%乙醇洗沉淀2次，真空干燥；
（9）以20µL 1×TE 溶解沉淀；
（10）电泳检测总DNA的浓度。
赞一下(2人) 回复此楼
流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
22楼2011-04-16 14:36:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
西瓜(金币+2, EPI+1): 热心、专业 2011-04-20 23:11:06
“我是从青霉菌里提的，开始用的SDS法，液氮研磨+500ul抽提缓冲液65℃水浴1h后，12000离心10min，加两次氯仿：异戊醇（24：1）后离心10Min,12000收集上清，加等体积异丙醇-20放置30min以上，13500离心，用75%乙醇洗无菌风吹干后加无菌水溶的，结果跑电泳只有RNA。”

青霉和曲霉我都提取过，加起来超过50个菌株，都能提取成功且作为模板PCR出来产物。我对这些步骤有点想法：
1、“65℃水浴1h”这个步骤我不知道起什么作用，是不是想热胀冷缩反复冻融加速真菌破胞？我在建宏基因组文库提取DNA的时候也没有用过那么高的温度。如果是想这样，就不必了，因为液氮研磨结束之后再高温也没用。当然我也只是猜测这一步是想达到这个效果，其实我是真的不知道设计这个步骤的人想要达到怎样的效果。
2、异丙醇只加了总体积的1/50，其作用是使得上下相分层更加清晰，这个添加量对蛋白质没有任何变性作用。我用异丙醇提取淀粉酶的时候加了十倍于酶液体积才能把蛋白质全都沉淀下来，而且沉淀再溶解的时候蛋白质损失很少的，所以别寄望于异丙醇能使得蛋白质变性。氯仿能使蛋白质变性，虽然效果比异丙醇好很多，但是也不能全部变性。真正能使蛋白质变性的是酚类，所以我才用1/4的苯酚（1/4的氯仿，1/2的含DNA的混合液）。我懒得加异丙醇。一般抽提可以两次，之后再加1/2的氯仿把苯酚萃取干净，这样可以把蛋白质去除得较好。
3、异丙醇可以用来沉淀DNA，而且沉淀出来也是絮状的。我在建宏基因组文库的时候DNA是用乙醇来沉淀的，把DNA过凝胶层析柱，洗脱液滴到乙醇里，有了DNA就马上沉淀，这些含有很少腐殖酸的DNA可以用枪头挑出来重新溶解跑胶。异丙醇当然也是可以沉淀RNA的，所以跑电泳的时候也有RNA。
4、多糖也可能会被异丙醇沉淀下来，假如用75%乙醇洗过，风干的DNA像是白色结块，不能完全溶解，不要紧，只要将其完全打散，再在50度水浴锅充分溶解，之后放到4度去冷冻，再高速离心去除沉淀取上清液就行。如果还想除去更多，可以在-20度过夜，结冰之后低温溶解，再高速离心取上清液就行。DNA可溶，所以不会损失太多的。这个沉淀不一定是白色，如果真菌产了孢子有了颜色，提取DNA的时候把孢子也用了，那么色素会有残留，这时候白色沉淀就是有了色素的颜色，但是不影响PCR。
赞一下(3人) 回复此楼
流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
23楼2011-04-16 15:08:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

江苏虞游

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
既然有RNA，楼主可以用RNase处理一下啊…………
赞一下(1人) 回复此楼
24楼2011-04-16 17:27:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

鬼笔坏坏

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-04-16 14:36:31:
如果有了RNA，当然就是表示已经破胞成功了，因为细胞内才有RNA。

我用的抽提液配方为
成分        浓度
NaCl        200mmol/L
EDTA-Na2        4mmol/L
SDS        2%
Tris-HCl(pH=8.0)        100mmol/L

与你的不一样，我用的方法和你的 ...

液氮研磨以后取粉末的时候，一离心管加多少研磨的量呢？？每次离心完看到菌丝体沉淀不多，那么提不出来会不会是因为我的菌量太少呢？？我会按照这个做一下，谢谢！！
赞一下 回复此楼
25楼2011-04-17 14:06:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
西瓜(金币+2): 热心 2011-04-20 23:10:34
液氮研磨之前菌丝体越干越好，干的才能磨成粉末，湿的加了液氮之后会成一块贴着研钵，不过我很少通过真空干燥弄干菌丝，每次都是挤得差不多就行了，都是成一块贴着研钵的，但是很少有一次提不出来的。我加了提取液到磨完菌丝的研钵里之后还用研棒把菌丝洗下来，吸取到EP管里之后不离心，直接抽提。我不知道是否应该离心之后取上清液抽提，没做过对比实验，不知道是否有差别，反正已经能提取出来，就不费那个心了。
赞一下(2人) 回复此楼
流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
26楼2011-04-17 16:58:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

caisanrenju

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
1949stone(金币+1): 有道理 2011-04-21 12:59:05
提DNA，绝对要用相应的试剂盒……不要在提取DNA上浪费时间
赞一下(2人) 回复此楼
27楼2011-04-18 17:18:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+2): 太热心 了 2011-04-21 08:48:16
两三天过去了，楼主提取得怎样了？
赞一下(2人) 回复此楼
流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
28楼2011-04-20 22:39:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yuxia82012

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
我看他的过程中貌似都没用苯酚使蛋白变性啊
赞一下(1人) 回复此楼
在等待中涅槃重生
29楼2011-04-20 22:47:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
所以我认为苯酚应该加，除非有什么我现在还不知道的特殊要求。
赞一下(1人) 回复此楼
流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
30楼2011-04-20 23:15:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 鬼笔坏坏 的主题更新
533/6返回列表上一页123456下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 生物学308分求调剂（一志愿华东师大） +4 相信必会光芒万� 2026-04-05 4/200 2026-04-05 07:42 by 544594351
[考研] 301求调剂 +10 121. 2026-04-04 10/500 2026-04-05 00:00 by 永字号
[考研] 0855求调剂材料 +6 红桃灼灼 2026-04-04 6/300 2026-04-04 23:35 by 果冻大王
[考研] 材料工程085601数二英一335求调剂 +6 双马尾痞老板2 2026-03-31 6/300 2026-04-04 22:29 by hemengdong
[考研] 一志愿安徽某211 0703化学总分339求调剂 +6 晚风不晚 2026-04-04 6/300 2026-04-04 20:11 by dongzh2009
[考研] 一志愿华北电力大学（北京），材料科学与工程学硕265，求调剂 +11 yelck 2026-04-03 12/600 2026-04-04 19:52 by dongzh2009
[考研] 333求调剂 +9 阿科逸 2026-03-31 9/450 2026-04-04 18:25 by macy2011
[考研] 一志愿哈尔滨工业大学085600英一数二337分求调剂 +11 lyz0427 2026-04-03 11/550 2026-04-04 15:31 by dongzh2009
[考研] 278求调剂 +6 Yy7400 2026-04-03 6/300 2026-04-04 09:53 by zhangdingwa
[考研] 311求调剂 +11 勇敢的小吴 2026-04-02 11/550 2026-04-03 21:46 by qlm5820
[考研] 315求调剂 +6 顺理成张 2026-04-03 8/400 2026-04-03 14:04 by 百灵童888
[考研] 抱歉 +5 田洪有 2026-03-30 5/250 2026-04-03 10:24 by linyelide
[考研] 289求调剂 +4 Acesczlo 2026-03-29 5/250 2026-04-03 10:09 by 不168
[考研] 一志愿上海海洋大学083200食品学硕，求调剂，接受其他专业 +6 what张 2026-04-01 7/350 2026-04-02 16:48 by zzsw+
[考研] 0832食品科学与工程学硕282调剂 +4 鱼在水中游a 2026-04-02 7/350 2026-04-02 14:12 by baoball
[考研] 一志愿厦门大学化学工程（专硕）-数二英二406分-求调剂 +5 厦大化工 2026-04-01 5/250 2026-04-02 10:03 by jp9609
[考研] 考研调剂 +12 Amber00 2026-03-31 12/600 2026-04-02 09:04 by sanrepian
[考研] 生物学327，求调剂 +5 书上的梅子 2026-04-01 6/300 2026-04-02 06:47 by ilovexiaobin
[考研] 285求调剂 +11 AZMK 2026-04-01 11/550 2026-04-01 22:40 by peike
[考研] 江苏苏北高校诚邀调剂同学 +3 zzll406 2026-03-31 3/150 2026-03-31 16:54 by 及时行乐fan
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭