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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助/交流】实时定量内参无条带！
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jack6335

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】实时定量内参无条带！

我最近两次提取RNA反转录后做实时定量，用actin做内参，可是actin老是没带或不特异，而我的目的基因扩增曲线和溶解曲线都很好，重新合成引物还是不行，不知为何，改为GADPH做内参也是没带，以前用同一个引物做的挺好的啊，没想到居然在内参上出了问题，求高人解读
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1楼2011-03-23 08:36:44
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7788945

银虫 (小有名气)
jack6335(金币+1): 我又合成了还是不行，换成GADPH还是不行，真崩溃！ 2011-03-23 12:13:06
我遇到和你一样的问题，在这问了老长时间没人答，后来又合成了一管actin才出，再不出重新提RNA在反转吧
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5楼2011-03-23 10:14:13
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yabxxh

木虫 (正式写手)
jack6335(金币+2): 3Q！ 2011-03-23 09:19:30
既然以前能PCR出来，现在却做不出来，应该是模版的问题，最好能跑一下cDNA电泳，看是否是均一的smear，内参应该很好得到的，好运
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2楼2011-03-23 09:15:08
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jack6335

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by yabxxh at 2011-03-23 09:15:08:
既然以前能PCR出来，现在却做不出来，应该是模版的问题，最好能跑一下cDNA电泳，看是否是均一的smear，内参应该很好得到的，好运

可是我的目的基因没问题啊！
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3楼2011-03-23 09:19:14
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yabxxh

木虫 (正式写手)
jack6335(金币+1): 我用以前反转的模板和这次的模板对比了一下，以前的actin能有单一条带，这次没有，我自己都觉得是不是我人品太差了，但几个目的基因还都有单一条带，我嘞个去！ 2011-03-23 12:16:04
引用回帖:
Originally posted by jack6335 at 2011-03-23 08:36:44:
我最近两次提取RNA反转录后做实时定量，用actin做内参，可是actin老是没带或不特异，而我的目的基因扩增曲线和溶解曲线都很好，重新合成引物还是不行，不知为何，改为GADPH做内参也是没带，以前用同一个引物做的挺 ...

请问你是直接进行荧光定量PCR的吗？如果是的话，建议
1.确定你的内参基因在组织中表达，表达丰度低的话不是很好扩增，当然也不太适合做内参
2.确定内参基因的引物和扩增的酶没有问题，不行的话可以直接引用别人的内参引物
3.先用普通PCR做一下，看是否能获得内参基因，如果普通pcr无法获得的话，调整一下参数
4.关键的我觉得还是引物和RNA的完整性，
顺便说一下，你这个很奇怪，我碰到的都是内参能扩增出来，目的基因扩增不出，你的正好相反，呵呵
好运
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6楼2011-03-23 10:22:26
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