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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 药学 » 药物分析 » 【交流】HPLC相同条件下，为何我们检测不出主峰杂质？
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olifor2010

金虫 (正式写手)

[交流] 【交流】HPLC相同条件下，为何我们检测不出主峰杂质？已有8人参与

现在的问题是，一种样品，相同批次，色谱条件相同，为何我公司检测不出杂质，而客户就能检测出杂质？
色谱条件如下：
       色谱柱——Hypersil BDS C18色谱柱（250mm*4.6mm*5µm）
       流动相—— 溶剂A：溶剂B=90:10

    溶剂A—用水溶解2.33g庚烷磺酸钠，加2.5ml的85%的磷酸，溶于400ml水中，用25%的氨水调节pH为2.5后加水至500.0ml。

    溶液B—乙腈
检测波长——205±4nm，标准360±20nm。
流速：1mL/min
色谱仪：Agilent1100 DAD HPLC
现在的问题是: 客户检我们每一批样品主峰后的一个杂质,而我们怎么检主峰后都没有杂质?但他们的溶剂进样后与我们是一致的,
客户检的色谱图如下:
局部方法图如下:

客户标准中要求系统适用性与系统精密度我们完全达到了。
即我们检测不出客户检的8.3min的杂质。
请教高手帮助分析下原因，多谢！




[ Last edited by olifor2010 on 2011-2-23 at 18:57 ]
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1楼2011-02-22 23:40:22
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youngc

金虫 (小有名气)
用客户的柱子试试看
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2楼2011-02-23 08:53:14
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bronzezt

至尊木虫 (职业作家)
★ ★
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qinhy(金币+1): 有时候好东西就是不一样~~ 2011-02-23 19:10:50
如果流动相处理是一致的话  就是柱子的问题了  我们以前也遇到过  客户的柱子比较好 就能检测出异构体  而我们就测不出
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3楼2011-02-23 14:24:27
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Edward-Lee

至尊木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by bronzezt at 2011-02-23 06:24:27:
如果流动相处理是一致的话  就是柱子的问题了  我们以前也遇到过  客户的柱子比较好 就能检测出异构体  而我们就测不出

色谱柱原因可能性较大，应考虑不同品牌色谱柱的区别
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4楼2011-02-23 15:29:12
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olifor2010

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by bronzezt at 2011-02-23 14:24:27:
如果流动相处理是一致的话  就是柱子的问题了  我们以前也遇到过  客户的柱子比较好 就能检测出异构体  而我们就测不出

使用的是同一品牌的统一种类与规格的色谱柱。现在只能说不是同一根了
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5楼2011-02-23 18:59:22
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80年后

金虫 (正式写手)
★ ★
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karl2100(金币+1): 3Q 2011-02-26 22:16:49
1 可能是色谱柱的问题
2流动相A一定要控制好 因为离子对试剂要求还是比较严格的
3 DAD是不是有BW的要求
4相同条件下多波长扫描 看是不是确实有这个杂质
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6楼2011-02-24 07:09:16
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olifor2010

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 80年后 at 2011-02-24 07:09:16:
1 可能是色谱柱的问题
2流动相A一定要控制好 因为离子对试剂要求还是比较严格的
3 DAD是不是有BW的要求
4相同条件下多波长扫描 看是不是确实有这个杂质

1、色谱柱换过一根新的，检不出来，再换，确定，有问题可能性不大；
2、离子对试剂的质量是否影响很大，是否会影响基线噪声；
3、DAD有样品带宽与参比带宽的要求，完全一致；
4、3维立体图，仔细看，没有！
今日客户传来新谱图，对比后发现我方的基线噪声很大，杂质完全可能会淹没在噪声里。
对与第2点“离子对试剂的影响”我很感兴趣，能否与您进一步交流呢？
多谢老师了
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7楼2011-02-26 21:16:00
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80年后

金虫 (正式写手)

这篇文章可以了解一下离子对试剂

★
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引用回帖:
Originally posted by olifor2010 at 2011-02-26 21:16:00:
1、色谱柱换过一根新的，检不出来，再换，确定，有问题可能性不大；
2、离子对试剂的质量是否影响很大，是否会影响基线噪声；
3、DAD有样品带宽与参比带宽的要求，完全一致；
4、3维立体图，仔细看，没有！
...

我找了一篇以前看的文章，是关于离子对的，现在也在做，出了很多问题，不知道是否适合你了解离子对试剂。

离子对试剂介绍
离子对试剂的优点
在过去，带电荷分析物的色谱分离通过离子抑制（小心调节流动相PH值以使分析物非离子化）来达到。然而，要确定离子抑制状态下的最佳流动相PH值，却往往需要额外的摸索过程。含有一个以上的可离子化成分的样品，通常是不稳定的。离子抑制的局限性导致了一种新的、更普遍适用的方法进行可离子化物质色谱分离的方法：离子对色谱。

离子对色谱由Gordon Schill博士于1973年建立，其方法是将离子性化合物添加到流动相中以促使离子与带电荷分析物形成配对离子。这些试剂由带有可离子化终端的烷基链组成。当在反相条件下用于常见的憎水性HPLC固定相时，离子对试剂可选择性的增加带电荷分析物的保留时间。

尽管离子交换色谱已经成为常见的分离模式，它并非在所有情况下都起作用。较离子交换色谱，离子对色谱的优点在于：
1、缓冲液制备简单；
2、碳链长度选择众多，可用于增加保留时间、改善分离性质；
3、显著缩短分离时间；
4、同时分离离子化和非离子化分析物；
5、分析结果重现性极好；
6、改善峰形。


Regis提供的离子对试剂
Regis生产超纯的阴离子磺酸盐（S-系列）和阳离子季胺（Q-系列）离子对浓缩液，碳链长度有：戊、己、庚、辛和月桂(十二)。在我们的产品命名中，碳链长度以红色数字标出，如：5，6，7，8和12。

纯度是关键因素
在我们生产离子对试剂的过程中，纯度是非常重要的质量标准。Regis S-和Q-系列离子对试剂根据工业最高质量标准进行合成，从而得到超乎寻常的纯度。这一点可参见表1：在波长低至200nm时对于Regis S-和Q-系列离子对试剂均可达到紫外透过性。在大部分情况下，这些紫外吸收值要低于用于HPLC梯度洗脱的乙腈和甲醇的紫外吸收值。尽管S-和Q-系列离子对试剂能在低于210nm的波长下使用，决定使用什么波长的关键因素还是在于检测器镜片和有机该性剂（如甲醇等）的综合情况。

表1：典型的光学吸收值[AUFS]（浓度0.005M）
光学吸收[AUFS]        光学吸收[AUFS]
S-系列        200nm        210nm        Q-系列        200nm        210nm
S5        0.006        0.002        Q5        0.060        0.001
S6        0.048        0.018        Q6        0.059        0.006
S7        0.008        0.001        Q7        0.022        0.009
S8        0.001        0.003        Q8        0.082        0.003
S12        0.002        0.003        Q12        0.102        0.013
乙腈        0.076        0.013        甲醇        0.940        0.510


Regis还提供批量磺酸盐和几种补充批量离子对试剂以及Rivier缓冲剂以补充磺酸盐S-系列和季胺Q-系列的分离能力。

如何为分析方法的建立选择合适的Regis离子对试剂
要选择合适的试剂，必须考虑烷烃长度。不同的烷烃链长度使得能够选择性分离分析物。链越长，离子对的憎水性越强，从而，保留时间也就越长。当链长度由戊基(Q5)增加到月桂基(Q12)时，保留因子几乎增长了20倍，如表2和表3所示。表2和表3中的数据显示出Q-试剂链长度决定了苯甲酸的保留时间，但不会影响到苯甲醇的保留时间。对于S-系列试剂也可以观察到类似的选择性。

表2：保留时间与链长度的关系
Q-系列        保留时间(min)        保留时间比
苯甲酸/苯甲醇
        苯甲酸        苯甲醇       
Q5        4.53        9.17        0.49
Q6        6.50        8.60        0.76
Q7        8.24        9.13        0.90
Q8        12.36        8.94        1.38
Q12        79.53        8.52        9.33


表3：保留时间比R与PH的关系
（流动相－水/甲醇 60/40中，R为苯甲酸和苯甲醇地保留时间比）
Q6        Q7        Q8
pH        R        pH        R        pH        R
7.50        0.59        7.50        0.88        7.51        1.06
6.50        0.70        6.51        1.00        6.54        1.29
5.50        0.96        5.52        1.23        5.50        1.59


以下是使用Regis离子对试剂来成功建立分析方法的指导：
1.        选择一根色谱柱，常为C18柱；
2.        准备流动相时仅使用HPLC级别的水和色谱级试剂；
3.        选择能给出最佳分离度的流动相成分和浓度；
4.        如果样品中有非离子化物质，在尝试离子化分离之前首先优化分离情况；
5.        选择合适的离子对系列试剂以提供相应的离子配对：对于酸性分析物使用Q-系列离子对试剂；对于碱性分析物使用S-系列离子对试剂；
6.        通过比较选择所得分离度最好的离子对试剂；
7.        一旦离子对试剂已经确定，调节流动相的pH值将分离度最大化；因为微小的pH值改变对保留性质和选择性都有较大的影响，所以仔细小心的小幅度调节pH值（参见表3）；
8.        理想状况下，流动相中的离子对试剂浓度应为0.005M，但是稍微增加离子对试剂可能会稍微增加保留性质并因此优化分离情况。

Regis 离子对试剂现货价目表：
货号        品名        包装
CFCQ-403026-25G        1-HEXANESULFONATE,SODIUM SALT (1-己烷磺酸钠)        25GM
CFCQ-403027-25G        1-HEPTANESULFONATE,SODIUM SALT (1-庚烷磺酸钠)        25GM
CFCQ-403127-100G        1-HEPTANESULFONATE,SODIUM SALT (1-庚烷磺酸钠)        100GM
CFCQ-403028-25G        1-OCTANESULFONATE,SODIUM SALT (1-辛烷磺酸钠)        25GM




2.2 高效液相色谱分离
    HPLC-ICP-MS联用技术在元素化学形态分析中的应用，已有文献总结；该技术的优点是应用范围广。以下是几种常用于形态分析的HPLC技术。
2.2.1 体积排阻色谱(SEC)
    SEC是按溶质的分子大小来分离的。其优点是：未知分子质量的样品在末端时间或在此之前淋出，因而可以预测色谱运行的终点；未知物的分子质量可以用校正的色谱系统来表征。SEC通常不会引起元素形态的丢失，适用于不稳定或与金属络合较弱的生物大分子。缺点是容量有限，不能分辨多组分样品，仅能分离分子大小不同且不能吸附在柱上的分析物。此外，有些化合物的保留时间会迁移至淋洗体积的末端以外，有时还会产生吸附效应和憎水效应，这些现象均会导致化学形态的转变和破坏。
2.2.2 离子交换色谱(IEC)
    与SEC相比，IEC最主要的优点是分离效率高，应用范围广。分离过程基于带电溶质离子与固定相的反电荷表面的交换平衡。溶质离子与流动相中的等电荷离子竞争固定相上的反离子。这种竞争决定了离子的相对保留时间，它依赖于流动相的pH值、离子强度和离子交换剂的性质。淋洗液中如含有高浓度的盐类，将会影响与ICP-MS的接口。
    此外不稳定的金属-蛋白的络合物中的金属会被缓冲液中的金属所代替。所以，IEC经常应用于以共价键结合的硒氨基酸或砷化合物。
2.2.3 反相高效液相色谱(RP-HPLC)
    RP-HPLC利用极性较流动相弱的固定相来分离分析物。保留机制是基于分析物的憎水性。该方法的应用范围广，对不同形态的分辨率高，重复性好。但是，固定相有离子交换性质，在pH>4时碱性分析物在柱上的吸附力很强。一般应用两种不同的淋洗液，其中至少有一种含有相当量的有机改进剂。淋洗生物分子需要用有机溶剂，还经常需要用酸。有机溶剂和酸很容易改变形态如蛋白-金属络合物。蛋白质被打开后，释放的金属即与其它络合剂结合导致形态改变。所以，RP-HPLC适用于分离以共价键结合的金属络合物而不适用于不稳定的金属络合物。
2.2.4 离子对色谱(IP-RPLC)
    RP-HPLC仅能分离非极性不带电的分析物。在分离带电的极性分析物时需要用离子对试剂。固定相是标准硅烷化的硅胶填料(如C8或C18。)，流动相是由如磷酸盐或醋酸盐、有机改进剂(甲醇或乙腈)和离子对试剂组成的水溶液缓冲体系。离子对试剂与分析物生成离子对保留在反相柱上。离子对试剂参与流动相中分析物与非极性固定相之间的平衡。在考虑离子对试剂时应尽量用溶于流动相的去质子的一价反离子，并对色谱柱和分析物不造成损害。用缓冲溶液控制水相的pH值和反离子的浓度以避免峰拖尾和出现多峰至关重要。与RP-HPLC相比，IR-RPLC的优点是方法的灵活性和多样性增加了。可以为一种特定的要求来设计分离条件。但是，方法所用的有机溶剂和酸也会影响元素的形态。离子对试剂更加重了这些问题，于是对分析物的稳定性的要求比单独使用RP-HPLC更高。
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8楼2011-02-26 21:53:42
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sfysoso

银虫 (初入文坛)
★
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庚烷磺酸钠 看看牌子来源是不是一样
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9楼2011-02-27 07:14:48
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olifor2010

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 80年后 at 2011-02-26 21:53:42:
我找了一篇以前看的文章，是关于离子对的，现在也在做，出了很多问题，不知道是否适合你了解离子对试剂。

离子对试剂介绍
离子对试剂的优点
在过去，带电荷分析物的色谱分离通过离子抑制（小心调节流动相P ...

首先非常感谢您老师！感谢您在百忙之中抽出时间来回复我，您是如此的热情与慷慨：）
您发的这篇文章对我帮助很大，使我意识到离子对色谱的流动相的pH值是非常重要的；
正如文章中所说，流动相的pH值控制非常精确，才可以；
我们实验室分别使用了5个人配置的流动相，2个人的出现了主峰分叉，即多峰现象，目前我还不是太明白原因（一般色谱出现多峰是由于柱填料塌陷造成的），1个人配置的流动相主峰后有小台阶状突起，2个人配置流动相主峰非常漂亮；
老师您能否就pH原因造成分叉进行进一步的讲解呢？
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10楼2011-02-27 22:58:16
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